Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 7
1.1. Катехоламины и возможность получения лекарственных препаратов на их основе 7
1.2. Использование методов органической химии для получения конъюгатов .. 15
1.3. Антитела к катехоламинам как инструмент исследования нейромедиаторов 30
Глава II. Обсуждение результатов 36
2.1. Синтез аминокислотных и пептидных производных 3,4 - диоксифенилаланина (DOPhA) 36
2.2. Синтез аминокислотных и пептидных производных норадреналина (НА) 49
2.3. Очистка синтезированных пептидов с использованием ВЭЖХ 52
2.4. Получение конъюгатов производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями 54
2.5. Иммунохимические исследования полученных конъюгатов 62
2.6. Фармакологические исследования аминокислотных и пептидных производных 3,4 - диоксифенилаланина 66
Глава III. Экспериментальная часть 68
Выводы 86
Литература 87
- Использование методов органической химии для получения конъюгатов
- Антитела к катехоламинам как инструмент исследования нейромедиаторов
- Получение конъюгатов производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями
- Фармакологические исследования аминокислотных и пептидных производных 3,4 - диоксифенилаланина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из задач современной органической химии, является разработка путей синтеза новых лекарственных препаратов. В последние десятилетия бурное развитие получила химия пептидов, что связано с широким спектром биологической активности, проявляемым соединениями пептидной природы, которые при введении в структуру лекарственных препаратов улучшают их некоторые фармакологические характеристики: растворимость в воде, про-лонгированность действия.
При низком содержании в организме катехоламинов используется предшественник этих моноаминов - 3,4-диоксифенилаланин, непосредственно участвующий в биосинтезе катехоламинов. Однако, эти соединения часто не оказывают желаемого терапевтического эффекта. Поэтому поиск новых препаратов как усиливающих, так и снижающих фармакологический эффект катехоламинов, является актуальным. Одним из способов снижения концентрации в организме нежелательных биологически активных соединений является применение высокоспецифичных антител к этим соединениям. В связи с этим проблема поиска соединений, с помощью которых можно получать высокоспецифичные антитела к катехолами-нам и методов их синтеза, является весьма актуальной.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является синтез аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, получение коньюгатов производных с белковыми носителями, изучение их антигенных и фармакологических свойств.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: разработать методики и синтезировать аминокислотные и пептидные производные катехоламинов; изучить физико-химические свойства полученных соединений; синтезировать конъюгаты полученных производных с белковыми носителями; - изучить антигенные и фармакологические свойства полученных соединений. Научная новизна. Впервые получены пролиновые, фенилаланиновые, моно-, ди-, триглициновые и аланил-фенилаланиновые производные 3,4-диоксифенил-аланина и норадреналина. Впервые синтезированы конъюгаты, полученных производных катехоламинов с бычьим сывороточным альбумином и тиреоглобули-ном. Установлено, что наиболее удобным для получения коньюгатов аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями, является использование в качестве сшивающего агента глутарового альдегида. Выявлена зависимость между специфичностью антител и длиной глицинового мостика.
Практическая значимость. Разработан способ синтеза аминокислотных и пептидных производных 3,4-диоксифенилаланина и норадреналина, и способ получения белковых коньюгатов производных катехоламинов. Синтезированные коньюгаты могут быть использованы при получении высокоспецифичных антител к 3,4-диоксифенилаланину.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на республиканской конференции, посвященной 50-летию Таджикского государственного национального университета (Душанбе, 1998г.), конференции молодых ученых и специалистов Республики Таджикистан (Душанбе, 1985-1989г.), третьей реги-нальной конференции по реактивам (Ташкент, 1990г.) и на конференции биохимического общества Республики Таджикистан (Душанбе, 1998г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах мшинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, и списка литературы, включающго 132 источника.
Использование методов органической химии для получения конъюгатов
Важное место в изучении различных закономерностей и регуляции иммунного ответа занимают так называемые конъюгированные антигены, представляющее собой полученные химическим путем соединения различных низкомолекулярных веществ с высокомолекулярными носителями[18]. Получение соединений такого типа предусматривает проведение стадии образования кова-летной связи между низкомолекулярным соединением и молекулой высокомолекулярного носителя с использованием методов органической химии. Впервые соединения такого типа были получены в начале 30-х годов. Ландштейнером [19]. Посредством диазосвязей он конъгировал с белками, через тирозиновый остаток, относительно простые химические группировки-аминобензойные, аминофениларсеновые, аминобензол-сульфоновые кислоты и др. В последующие годы наибольшее распространение в исследовательских целях получили конъгированные антигена, состоящие из того или иного белка и динитрофенильной или тринитрофенильной группы, присоединенной через є-аминогруппу лизина:
Причем соответствующие сульфонаты вводят в реакцию в 10- кратном молярном избытке по отношению к содержанию лизина в белке [20]. Реакцию проводят при 37С при постоянном перемешивании в темноте, поскольку ДНФ- группы светочувствительны. ДНФ- производные белков удобнее получать с использованием динитробезолсульфоновой кислоты. В этих условиях в реакцию с динитробезолсульфонатом вступают, почти, исключительно в- аминогруппы лизина. N-концевыми аминогруппами на практике можно пренебреч. Фенольные ОН- группы тирозина в вышеописанных условиях не вступают в реакцию, сульгидрильные группы также не оказывают влияния на степень замещения. Аналогично ДНФ- белка могут быть получены ТНФ- производные, путем взаимодействия тринитробензолсульфоновой кислоты и белка в 0,2м боратном буфере с рН 9,2.
В дальнейшем реакция конъюгированния получила широкое распространение в таких областях иммунохимии, как иммуноферментный анализ и получение синтетических антигенов. На наш взгляд с практической точки зрения наибольшее значение имеет разработка методов иммуноферментного анализа, получившего широкое распространение в практической медицине для диагностики многих заболеваний, а также для качественного определения различных токсинов в биологических экстрактах [18,28-34]. В этом методе анализа применяются коньюгаты ферментов с антителами, для получения которых чаще всего используются следующие методы [20]: 1. сшивание глутаравым альдегидом. а) одноступенчатый метод применяется для получения коньюгатов в щелочной фосфатазе; б) двухступенчатый метод используется для получения коньюгатов пероксидазы хрена. 2. Коньюгирование после периодатного окисления углеводов в составе гликопротеидов применяется для получения коньюгатов пероксидазы хрена. 3. Сшивание N, N1 - о - фенилендималеимидом применяется для получения коньюгатов галактозидазы. Очень часто инсектным молекулам иммуноглобулинов предпочитают Бав1- -фрагменты, поскольку в этом случае значительно уменьшается их специфическая адсорбция. Для описания уровня фона используются специфические FaB -фрагменты. При проведении реакции коньюгированния большое значение имеет блокирование тех функциональных групп белка, которые не должны участвовать в этой реакции или принименяют реагенты, избирательно вступающие в реакцию только с одними типами функциональных групп. Например, Fae1 - фрагменты над блокированными SH- группами присоединяют 3- галактозидазу через N , N - о - фе-нилендималеимид, которые избирательно реагируют с сульфагидраксильными группами [21]. Для блокирования SH - групп применяют N - этилмалеимид, после чего коньюгирование с ферментами можно проводить глутаральдегидным или периодатными методами. Количество N - этилмалеимида необходимого для блокады SH- групп, определяют по интенсвности поглощения при длине волны 310 нм. После взаимодействия с SH- группами поглощение N - этилмалеимида при этой длине волны исчезает [22].Малеимидобензоил N - гидрооксисукцинимид-ный эфир реагирует с аминогруппами (гидрооксисукцинимидный эфир), так и с SH- группами (малеимидная часть) [21].В первую очередь реагируют группы антител, во вторую SH- группы ферментов. Поскольку у антител нет свободных SH-групп, полимеризация не происходит. Получение коньюгатов ферментов с антителами с помощью глутарового альдегида схематически можно изобразить следующим образом: Реакция проводится путем непосредственного смешивания иммунглобулинов, ферментов и глутарового альдегида при 4 С в фосфатно-солевом буферном растворе ФСБ с последующим диализом против ФСБ , а затем 0,05 м трис-НС1 -буфера с рН 8,0 и разбавлением трис-НС1 - буфера с рН 8,0, содержащим ВСА и NaN3[23].
Антитела к катехоламинам как инструмент исследования нейромедиаторов
Получение антител к биологически активным соединениям имеет определенный научный интерес. Индуцированные специфические антитела способствуют решению ряда задач медицинского и биологического профиля в том числе: 1. Идентификации и количественного определения различных соединений в биологических жидкостях при помощи иммунологических методов и некоторых других родственных способов [55,56,57,58,59,60 ,61, 62,63]. 2. Выяснения вопросов метаболизма и фармакокинетики лекарственных препаратов [64,65]. 3. Определения локализации физиологически активных соединений в организме [66,67]. 4. Устранения аллергических реакций на фармакологические препараты [68]. 5. Изучения взаимодействия гормонов и других биологически активных веществ с соответствующими рецепторами, а также для обнаружения рецепторов [69,70]. Основная литература по этой проблеме касается получения антител к различным соединениям для использования в радиоиммунологических методах.
Являются весьма интересными данные о применении антител для снижения уровня биологически активных веществ крови и тканях при определенной патологии. Известно использование антител как терапевтических средств для предотвращения вредного воздействия на организм целого ряда экзотоксинов [71,72,73]. Установлено, что антитела, к ферментам и рецепторам клеточных мембран, могут подавлять активность этих ферментов [74,75,76] или блокировать специфические центры связывания рецепторов [77 ,78]. В экспериментах, как in vitro, так и in vivo, показано специфическое противодействие антител физиологическому действию пептидных гормонов [79,80,81,82,83,84,85,86].
Возможность получения антител к низкомолекулярным соединениям - гаптенам сыграла значительную роль в развитии неинфекционной иммунологии и иммуно-фармакологии. Специфические антитела блокируют стероидные гормоны [87,88,89], простагландины [90], серотонин [91], гистамин [68] и различные лекарственные препараты [92,93,94,95,96,97,98, 99,100].
Для получения антител к низкомолекулярным соединениям (гаптенам) необходимо связать их прочной ковалентной связью с антигенным высокомолекулярным белковым или полипептидным носителем или полиэлектролитами, причем сила и стабильность этой связи являются критериями антигенности образующегося комплекса. Эту стабильность обеспечивает простая ковалентная связь. В результате этого получаются антигенные препараты, индуцирующие при введении в организм высокоспецифичные антигаптенные антитела и объединяющие в себе три, различных по выполняемым функциям, соединения: молекула высокомолекулярного носителя выполняет несущую (шлепперную) функцию, молекула гаптена играет роль антигенных детерминант, мостик соединяет антигенную и несущую части молекулы коньюгата по схеме 4.
В качестве антигенного носителя чаще всего применяют различные белки, например, сывороточный альбумин [101], гамма-глобулин [102], гемоцианин [103], а также синтетические полипептиды [104]. Эти соединения имеют достаточное количество различных функциональных групп, пригодных для образования ковалентной связи с молекулой гаптена. Получены результаты, свидетельствующие о влиянии молекулы носителя на иммунологическую специфичность и связывающую способность антител в иммунных ответах [103].
Реакции ковалентного связывания гаптенов с белками проводят в водных растворах при пониженной температуре и нейтральных значениях рН раствора, т.е. в условиях, позволяющих избежать денатурацию белков. К настоящему времени известны примеры синтеза широкого набора конъюгатов биологически активных соединений с белками [105,106]. При получении антител, обладающих высокой специфичностью по отношению к данному гаптену, важную роль играют такие факторы, как структура конъюгированного антигена, применяемого при иммунизации, длина соединяющего мостика и характер иммунизации.
Один и тот же гаптен можно связать с белковой молекулой различными способами. Установлено, что характер, размер и положение ковалентной связи между гаптеном и носителем существенно влияют на специфичность индуцируемых антител [107]. Кроме того, особое значение приобретает такая характеристика конъюгированного антигена, как количество присоединившихся молекул гаптена к молекуле носителя. Показано, что этот фактор сильно влияет на титры и специфичность полученных антител [108].
В последние годы предприняты попытки получения антител к катехоламинам. В частности были получены антитела к некоторым метаболитам этих симпатоми-метических аминов [109,110,111]. Такие антитела были использованы для разработки методов радиоиммунологического определения соответствующих гаптенов. Конъюгированные антигены были синтезированы на основе монометилирован-ных [112,113,114] и диметилированных [115] производных катехоламинов. Показана возможность получения антител к норадреналину при иммунизации кроликов антигеном, в котором катехоламин связывается с альбумином или полиглу-таминовой кислотой посредством 1-этил 3 (-3-диметиламинопропил) карбо-диимида. Антитела, индуцируемые этими конъюгатами, распознавали различия в функциональных группах бензольного кольца, но не были чувствительны к изменениям в непосредственной близости к кольцевой аминогруппе катехоламинов. Они практически одинаково связывали как норадреналин, так и адреналин.
Получение конъюгатов производных 3,4-диоксифенилаланина с белковыми носителями
Получение антител к DOPhA открывает большие перспективы как в плане изучения кругооборота в организме этих чрезвычайно важных соединений, так и в выяснении их роли в патогенезе целого ряда заболеваний. В современной литературе описано получение антител к DOPhA [117], которые могут быть использованы для определения содержания этого катехоламина в крови и тканях.
В результате проведенных ранее исследований Мива [117] и Динером [118] было установлено, что антитела к катехоламинам обладают различной специфичностью, которая зависит от вида применяемого конъюгированного антигена. При этом основное внимание авторами уделялось способу конъюгации катехоламина с носителем. Из вышеуказанных данных известно, что специфичность антител к гаптенам зависит также и от ряда других факторов, к которым относятся: количество гаптена, ковалентно связанного с антигенным носителем и вид этого носителя.
В этой работе мы попытались получить специфические антитела к DOPhA. При этом мы основывались на сведениях о существовании определенной зависимости между специфичностью, титром индуцируемых антител и способами конъюгации, видом входящего в состав конъюгата гаптена и количеством присутствующего в антигене гаптена.
Так, имеются данные, свидетельствующие о том, что с удлинением "ножки", связывающей гаптен и носитель, возрастает специфичность антител к гаптену [131]. На наш взгляд, применение сочетающего реагента, позволяющего создать такую "ножку", может определенным образом повлиять на эту характеристику антител к DOPhA. Возможно, этим объясняется неудачная попытка получения специфических антител к катехоламинам предпринятая Spector [130], который осуществил связывание катехоламина с белком путем непосредственного взаимодействия алифатической аминогруппы НА с карбоксильными группами носителя с образованием пептидной связи.
Далее, мы также попытались оценить влияние различных антигенных носителей, входящих в состав конъюгированного антигена, на иммунохимические параметры индуцируемых антител к DOPhA аминокислотным и пептидным производным DOPhA. Из многочисленных литературных источников [112,117,118,129,130] известно, что применение в качестве носителя белков с разной молекулярной массой приводит к получению антител с неодинаковой специфичностью.
В связи с этим в работе нами были использованы BSA и Туг, отличающиеся по молекулярной массе, антигенной активности. Кроме этого эти белки, имея определенную первичную структуру, содержат разное количество тех аминокислотных остатков, к которым ковалентно присоединяются молекулы гаптена.
В настоящее время для получения пептид-белковых коньюгатов довольно часто используется такой сочетающий бифункциональный реагент, как глутаро-вый альдегид. Синтез коньюгатов приведен на схеме. 11 Как видно из этой схемы, в образовании коньюгата участвуют аминогруппы пептида и белка.
Реакцию конгьюгирования проводили в фосфатном буферном растворе (0,05 М, рН 7-2) при комнатной температуре и молярном соотношении белок-гантен 1-4-275 - 1-ь512. Подобное соотношение обеспечивало 5-10 - кратный избыток гаптена по отношению к функциональным группам носителя, способным участвовать в реакции коньюгирования белка в аминогруппу осуществляемую реакцией с боргидридом натрия в течение 1 часа.
Очистку коньюгатов от непрореагировавших низкомолекулярных реагентов осуществляли диализом против дистиллированной воды в течение 3 суток.
Степень конъюгации определяли по методу Лоури. Для этого было необходимо первоначально определить спектроскопические характеристики гаптенов. Спектральные измерения проводили на спектрофотометре СФ-26 в кварцевых кюветах с толщиной слоя анализируемого раствора 1 см.
УФ-спектры растворов синтезированных производных 3,4-диоксифенилаланина приведены на рис.2. Из этих данных видно, что с увеличением длины глицинового спейсера снижается коэффициент молярного поглощения исследуемых соединений при 280 нм.
Фармакологические исследования аминокислотных и пептидных производных 3,4 - диоксифенилаланина
Сыворотки, разбавленные до определенного титра, позволяющего связывать лишь 50% меченного DOPhA, использовали для оценки перекрестной реактивности. Из результатов перекрестной реактивности (рис.5) видно, что связывание H-DOPhA зависит от вида добавляемых нативных катехоламинов. Приведенные результаты свидетельствуют о низкой перекрестной реактивности полученных антител при взаимодействии с ГА, НМН и МН (от 0,1 до 4,1 %). Вместе с тем наблюдается незначительная перекрестная реакция с НА (12%). Это говорит о том, что антитела к DOPhA способны "узнавать" структурные изменения в молекуле катехоламина, как в ароматической ее части, так и в непосредственной близости от нее. Наряду с этим, антитела не обладают такой высокой специфичностью для заместителей при аминогруппе и а - углеродном атоме алифатической части, которые имеются в молекуле А и НА. Наибольшая перекрестная реактивность антител по отношению к НА, вероятно, вызвана большим структурным сходством DOPhA с НА.
Таким образом, как видно из результатов экспериментов при сравнительном анализе специфичности антител существенных различий между антисыворотками, полученными при использовании двух разных белков-носителей не наблюдалось в то же время отличалось увеличение специфичности антител при увеличении длины мостика от Gly до Gly-Gly-Gly.
Взаимодействие DOPhA с антителами можно оценить путем инкубации соответствующих антисывороток с 3H-DOPhA. Метод сатурационного анализа [92] позволяет рассчитывать константы, характеризующие сродство антител к антигенам. Расчет этих констант мы производили как описано в главе "экспериментальная часть", основываясь на анализе Скэтчарда [132].
В рис. 5 приведены параметры, характеризующие связывание 3Н DOPhA антисыворотками, полученными к соответствующим конъюгатам. Можно видеть, что H-DOPhA связывается антисыворотками, с высоким сродством.
Наибольшее значение кажущейся равновесной константы ассоциации (Касс) получено в случае иммунизации антигеном BSA-Gly-Gly-Gly-DOPhA и приблизительно равно 1,13 х 109 м"1. Наряду с этим, Касс для антител, индуцированных к конъюгатом BSA-Gly-Gly-DOPhA и BSA-DOPhA несколько ниже по величине и соответствует значениям 8,73 х 108 и 4,82 х 108 м"1, соответственно. Это говорит о том, что антигены, содержащие Gly, Gly-Gly и Gly-Gly-Gly, вызывают индукцию антител с меньшим сродством к DOPhA, по сравнению с антителами, полученными к BSA-Gly-Gly-Gly-DOPhA. Значения этих констант очень высоки, что свидетельствует о высоком сродстве связывающего сывороточного фактора к DOPhA. Аналогичная картина наблюдается в случае исследования антител, индуцированных к конъюгатом, где в качестве белка-носителя был использован Туг. Здесь также можно отметить, что наибольшим сродством к DOPhA обладают антитела, полученные при иммунизации конъюгатом Tyr-Gly-Gly-Gly-DOPhA (Касс = 1,36 х 108 м"1) по сравнению с Tyr-Gly-Gly-Gly-DOPhA (Касс = 5,94 х 108 м"1) и Tyr-Gly-DOPhA (Касс = 2,40 х 108 м"1), а также исходным Туг-DOPhA (Касс = 1,77 х 108 м"1). Таким образом, данные, полученные путем применения метода сатурационного анализа, позволяют заключить, что введение в антиген, содержащий DOPhA и белок, трех аминокислотных остатков Gly-Gly-Gly приводит при последующей иммунизации к индукции антител, обладающих наибольшим сродством к DOPhA по сравнению с антигеном содержащим два аминокислотных остатка Gly-Gly и один Gly. а - адреномиметическая активность исследовалась на изолированном полоске селезенки кроликов. Кроликов декапитировали без наркоза и готовили отрезки селезенки длинной 25-35 мм, шириной 2 -3 мм, которые закрепляли в ванночке, содержащей 35 мл раствора Кребса - Хейслейда. Раствор постоянно аэрировали. Температура 37 С поддерживалась ультротермостатом ТЛ - 150 с контактным термометром. Длительность воздействия на селезенку испытуемых веществ составляла 5 минут. Отмывные вещества после введения проводили в течении 2 минут. Интервал между введением составлял 40 минут. Исследование проводили в такой последовательности: в начале записывали контрольное сокращение полоски селезенки на воздействие раствора 3,4 - диоксифенилаланина в концентрации 1x10"6 г/мл. Затем после отмывания селезенки от 3,4 - диоксифенилаланина в ванночку в возрастающих концентрациях вводили испытуемые соединения. Исследуемые препараты испытывались в концентрациях 1x10" , 1x10" , 1x10" , 1x10"4 г/мл. Оценку а - адреномиметической активности испытуемых соединений проводили по способности, вызывать сокращение изолированной полоски. Сравнение а - адреномиметической активности проводили с 3,4 - диоксифенилалани-ном, которые испытывали в конценрациях 1x10"6 г/мл.
Проведенные исследования показали, что наиболее активным препаратом оказался Н - Gly - DOPhA - ОН в концентрации 1x10"6 г/мл, он вызывал такую же амплитуду сокращения полоски селезенки, как 3,4 - диоксифенилаланин в концентрации 1x10" г/мл (рис.7). Это дает право рекомендовать данный препарат и исследовать на моделе экспериментального паркинсанизма в сравнительном аспекте с адреналином и дофанином.
