Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Синтез, строение и свойства тиофена и его производных 8
1.1.1 Нахождение в природе, физические свойства. Методы получения .
1.1.2 Строение и химические свойства 10
1.1.2.1 Реакции электрофильного замещения 11
1.1.2.2 Реакции нуклеофильного замещения 15
1.1.2.3 Другие свойства и синтетические возможности соединений тиофенового ряда
1.2 Производные тиофена в современной фармакологии: синтез и терапевтическая направленность
1.2.1 Соединения с антиартритной активностью 21
1.2.2 Физиологически активные вещества 22
1.2.3 Препараты для лечения бронхиальной астмы 24
1.2.4 Противомикробная активность тиофенсульфаниламидов 26
1.2.5 Препараты для лечения онкологических заболеваний и СПИДа 28
1.2.6 Класс психотропных средств 30
1.2.7 Офтальмологические и другие препараты 32
1.3 Значение виртуального скрининга в создании синтетических лекарственных препаратов 33
1.3.1 Разработка лекарственных препаратов через оптимизацию соединений-лидеров 34
1.3.2 Алгоритмы компьютерного тестирования и конструирования для отбора соединений с заданными фармако-кинетическими характеристиками 37
1.3.3 Методы конструирования по принципу структурного подобия 37
1.3.4 Методы статистического анализа данных 39
1.3.4.1 Граничные фильтры: правила Липински, концепция "сходство с лидерами" 40
1.3.4.2 Ограниченные возможности первичного фильтрования 43
1.3.4.3 КССА-моделирование и карты Кохонена 44 1.4 Обобщение 47
2. Химическая часть 48
2.1 Разработка методов синтеза и строение ряда новых производных тиофена и 2-бромтиофена 49
2.1.1 Синтез (тиофен-2-сульфонил)пропановых кислот и библиотеки 3-(тиофен-2-сульфонил)пропанамидов 49
2.1.2 Синтез и строение ряда (тиофен-2-сульфониламино)карбоновых кислот и их амидных производных 57
2.1.2.1 (Тиофен-2-сульфониламино)карбоновые кислоты на основе линейных алифатических аминокислот 58
2.1.2.2 (Тиофен-2-сульфониламино)карбоновые кислоты на основе аминокислот гетероциклического строения 61
2.1.2.3 (Тиофен-2-сульфониламино)карбоновая кислота на основе п-аминобензойной кислоты 64
2.1.2.4 Амидные производные (тиофен-2-сульфониламино)-карбоновых кислот 64
2.1.3 Синтез и строение [(тиофен-2-сульфонил)фенил)]аминоуксус-ных кислот и их амидных производных 72
2.1.4 Синтез и строение 2-бром-5-нитротиофена и его производных 75
2.2 Виртуальный анализ свойств ряда новых производных тиофена и 2-бромтиофена 81
2.2.1 Влияние строения аминокислотного фрагмента 82
2.2.2 Влияние строения фрагмента, связанного с сульфогруппой 88
2.2.3. Влияние строения аминного остатка в амидном фрагменте 91
2.3 Синтез соединений для биологического тестирования и результаты испытаний 93
2.3.1 Виртуальный отбор 93
2.3.2 Синтез отобранных соединений и результаты испытаний 95
3. Экспериментальная часть 98
3.1 Исходные вещества, растворители 98
3.2 Методики получения 98
3.3 Методы аналитического контроля 105
3.4 Идентификация полученных соединений 106
Выводы 135
Литература
- Нахождение в природе, физические свойства. Методы получения
- Противомикробная активность тиофенсульфаниламидов
- (Тиофен-2-сульфониламино)карбоновые кислоты на основе линейных алифатических аминокислот
- Методы аналитического контроля
Введение к работе
На протяжении последних 30 лет фармацевтическая индустрия активно проводит поиск новых препаратов на основе соединений, содержащих в своей структуре тиофеновый фрагмент. Исследования в этой области привели к созданию эффективных лекарственных средств. Из литературных данных известны разнообразные субстанции, содержащие тиофеновый фрагмент - вещества с антиартритной активностью, физиологически активные вещества, препараты для лечения бронхиальной астмы, онкологических заболеваний и СПИДа, офтальмологические, противомикробные и психотропные средства. С другой стороны, известно, что для тиофена характерны такие свойства, как высокая устойчивость цикла к раскрытию, лёгкость введения различных заместителей путём проведения высокоселективных реакций электрофильного и нуклеофильного замещения, возможность проведения реакций присоединения по активным функциональным группам либо реакций отщепления "лишних" функциональных групп. Эти свойства продолжают создавать широкие исследовательские возможности для получения новых производных тиофена, которые могут обладать разнообразными фармакологически-значимыми видами активности.
Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре органической химии Ярославского государственного педагогического университета им. К.Д. Ушинского по теме "Разработка методов муль-тистадийного синтеза, изучение структуры и свойств оригинальных гетероциклических и карбоциклических соединений, пригодных для биохимических исследований" и выполненных в рамках договоров о научно-исследовательской работе с предприятием "Контакт-Сервис", г. Долгопрудный, Московской обл. (2000-2002 гг.), с химической компанией "Chemical Diversity Inc.", Сан-Диего, США (2003-2004 гг.) и в соответствии с Программой Министерства образования Российской Федерации "Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники на
2003-2004 годы" в рамках проекта "Теоретические основы получения функ-ционализированных полиядерных ароматических соединений многоцелевого назначения" (договор о научно-исследовательской работе с Ярославским государственным университетом им. П. Г. Демидова).
Цели работы:
Разработка методов получения, изучение строения и свойств ряда новых производных тиофена, удовлетворяющих современным требованиям медицинской органической химии и отличающихся широким структурным разнообразием за счёт варьирования фрагментов, связанных с тиофеновым циклом и реагентов, используемых на стадии комбинаторного синтеза.
Разработка метода виртуального отбора структур для первичного биологического тестирования, целенаправленный синтез отобранных соединений и испытания их биологической активности на определённой линии опухолевых клеток.
Научная новизна и практическая значимость работы заключается в следующем:
1. Предложен ряд новых универсальных схем получения сульфопроиз-
водных тиофена с возможностью использования широкого структурного раз
нообразия реагентов на стадиях промежуточного и комбинаторного синтеза.
2. Разработана схема получения 2-ЇЧ-замещенньіх-5-нитротиофенов,
включающая стадии нитрования 2-бромтиофена и замещения атома брома в
2-бром-5-нитротиофене N-нуклеофилами гетероциклического строения.
3. Синтезировано и идентифицировано совокупностью методов ЯМР
'Н-, ЯМР ,3С-, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии 233 новых, ранее не
описанных в литературе соединений - производных тиофена.
4. Отработана методика рационального виртуального отбора соедине
ний для дальнейшего синтеза и испытания на определённый вид биологиче
ской активности. Синтезированные по результатам отбора соединения про-
тестированы на проявление ингибиторной активности по отношению к Нер-2 линии опухолевых клеток.
По теме работы опубликовано 5 статей в научных журналах и 3 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях. Результаты работы были доложены на 4-ом Всероссийском симпозиуме по органической химии. "Органическая химия - упадок или возрождение?", Москва-Углич, 5-7 июля 2003; Международной конференции "Чтения Ушинского", Ярославль, март 2003; XL Всероссийской конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии, Москва, 19-23 апреля 2004.
Положения, выносимые на защиту:
Разработка методов получения новых производных тиофена, отличающихся большим структурным разнообразием за счёт широкого варьирования реагентов на стадиях промежуточного и комбинаторного синтеза.
Доказательства строения синтезированных соединений и соответствие их свойств современным требованиям медицинской органической химии.
Планирование синтеза новых производных тиофена с заданными свойствами на основе рациональных методов виртуального отбора и оценка их биологической активности как подтверждение актуальности исследований в выбранном синтетическом направлении.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, химической и экспериментальной частей, выводов, списка использованной литературы. Работа изложена на 152 страницах, включает 34 схемы, 25 рисунков, 12 таблиц. Список литературы включает 120 источника.
Нахождение в природе, физические свойства. Методы получения
Присутствие 2-заместителей в тиофене, проявляющих +J, -J, +М эффекты (алкил-, галоген-, алкокси-), вызывает дополнительную стабилизацию положительного заряда, и направляют электрофил в свободное а-положение (схема 7) [5].
Указывается, что такая дополнительная стабилизация невозможна при атаке положения 4- и менее эффективна в случае атаки положения 3-. Ориентирующий эффект галогена в положении 2- значительно слабее а-направляющего эффекта гетероатома, поэтому образуются исключительно 5-производные. Если активирующее влияние заместителя в положении 2- более сильное, то возможно образование 3-производных. Так, при нитровании 2-метилтиофена соотношение 3-изомера к 5-изомеру составляет 30:70, а при нитровании 2-метокситиофена-40:60 [12].
Присутствие 2-заместителей в тиофене, проявляющих -J и -М эффекты (СНО, CN, СООН, NO2, S03H, SO2CI) приводит к дестабилизации о-комп-лекса и увеличивает возможность образования 4- замещённых продуктов. Чем сильнее этот электронный эффект (в зависимости от природы заместителя или условий реакции, как, например, при использовании избытка катализатора), тем больше степень замещения в положение 4-. Например, при бро-мировании 2-альдегидтиофена в присутствии 2-3 моль хлорида алюминия на 1 моль тиофена, образуется исключительно 4-изомер, а при нитровании данного альдегида соотношение изомеров 3:1 в пользу 4-изомера [13]. Нитрование 2-ацетилтиофена даёт 4- и 5-нитропроизводные в соотношении 1:1 [14]. В литературе [1, 2, 6] имеются примеры электрофильного замещения а-заместителей (Br, СООН) в производных тиофена на другую функциональную группу. Например, ацилирование 2,5-дихлортиофена уксусным ангидридом в присутствии каталитических количеств ортофосфорной кислоты при 100 С даёт 80%-ный выход 2-хлор-5-ацетилтиофена.
Электронодонорные заместители в третьем положении благоприятствуют замещению в положение 2-, так как только при этом имеющийся заместитель может эффективно участвовать в сопряжении с кольцом (схема 8) [5].
Стерические факторы могут приводить к конкурирующей атаке в положение 5-, что также достаточно благоприятно. Например, при ацетилиро-вании (или формилировании) 3-третбутилтиофена образуются только 5-производные [15]. Если в положении 3- присутствует алкильный радикал, то замещение происходит в положение 2- с небольшим количеством 5-изомеров. Например, формилирование и ацетилирование 2-метилтиофена даёт 80% 2-изомера и 20% 5-изомера [16].
Суммарный эффект электроноакцепторных групп в положении 3-(благодаря своему мета-ориентирующему влиянию и а-направляющего действия гетероатома) допускает атаку нового заместителя положения 5- и, в меньшей степени, положения 4-, но препятствуют атаке в положение 2-. Например, при нитровании и галогенировании тиофен-3-карбоновой кислоты образуются только 5-изомеры [12]. Таким образом, наличие заместителей в молекуле тиофена, проявляющих различные ориентирующие и электронные эффекты, оказывает неоднозначное влияние на локализацию нового заместителя в тиофеновом цикле в реакциях электрофильного замещения. Кроме того, большое влияние на скорость и направленность электрофильной атаки оказывает количество имеющихся заместителей в цикле тиофена и их пространственное строение.
Реакции нуклеофильного замещения Реакции типа SN не столь многочисленны как реакции типа SE, но также характерны для производных тиофена. Реакциям типа SN подвержены тиофены, содержащие в качестве заместителей сопряжённые электроноак-цепторные группы. Наиболее всесторонние исследования нуклеофильного замещения в ряду тиофена проведены на галогеннитропроизводных, но сделанные выводы имеют общее значение [4].
Установлено, что при любом взаимном расположении галогена и нит-рогруппы в молекуле галогеннитротиофена наблюдается сильная активация галогена в реакциях с нуклеофилами и относительная скорость реакции очень высокая. Представленные на схеме 9 промежуточные комплексы 1-4 имеют повышенную стабильность за счёт участия нитрогруппы в делокали-зации отрицательного заряда (в большей степени, чем в бензольном аналоге) и способности атома серы стабилизировать соседний карбанионный центр.
Противомикробная активность тиофенсульфаниламидов
В фармакологии существует понятие сульфаниламидных препаратов. Химическое родство сульфаниламидов определяется наличием ароматического (или гетероциклического) фрагмента и сульфамидной группы. Как правило, все сульфаниламиды являются пептидомиметиками и широко используются в медицине в качестве антимикробных средств. Их фармакологическое единство связано с механизмом бактериостатического эффекта по угнетению ферментов, продуцируемых микроорганизмами [40].
В медицинско-химической литературе можно найти целый ряд примеров биологически активных соединений - производных тиофена в сочетании с сульфамидной группой. Некоторые примеры подобных соединений приведены выше (рис. 1, 2). Их отличительной структурной особенностью является либо замыкание сульфамидной группы в цикл (конденсированный с циклом тиофена), либо линейное расположение сульфамидной группы (как правило, в положении 2- цикла тиофена). Примерами сульфаниламидов второго типа являются соединения 1-4 (рис.4), проходящие скрининг на различные виды биологической активности.
В работах [41,42] отмечено, что соединения 1 и 2 проявляют ингиби-рующее действие в отношении фермента коллагеназы К] микроорганизма Clostridium histolyticum. Для 4,5-дибромтиофен-2-сульфамидного соединения 3 характерна энзимная активность в отношении проколлаген-С-протеиназ [43]. Биологическое тестирование проводилось методом in vitro на специфичных клеточных культурах с определением величины IC50 (англ. inhibition concentration). Данная величина для вещества 3 составляет 0,032 млмоль/л. Оригинальная двойная структура соединения 4 оказывает ингиби-рующее действие на рекомбинантную фармезилтрансферазу, выделенную из клеток крыс. В публикации приводятся данные по значениям IC50 для соединения 4 и других тестируемых соединений [44].
Вызывают интерес публикации, в которых имеются сведения о проявлении биологической активности у тиофеновых производных со свободной карбоксильной группой. Известно, что полярная -СООН группа способствует лучшему проникновению вещества через клеточную мембрану, но снижает показатели проявления разных видов биоактивности.
Методом in vitro показана активность соединений 1 и 2 (рис.5) против действия металлопротеиназ А и В (ММР-2 и ММР-9), а также указаны концентрации веществ при которых наступает полное подавление активности указанных энзимов [45]. В этой работе опубликованы также данные для дру гих структурных аналогов соединений 1 и 2, содержащих свободную карбо-сильную группу.
Фармацевтические компании всего мира в последнее время уделяют большое внимание разработке онкопрепаратов. Подобные лекарственные средства встречаются и среди производных тиофена (1-4, рис.6).
Оригинальное соединение 1 было запатентовано фирмой Astra Zeneca (разработчик - BTG National Cancer Institute) как противоопухолевый препарат Raltitrexed, который оказался в ряде случаев эффективным для лечения некоторых видов лейкемии [46]. Сходную структуру имеет соединение 2, проходящее стадию биологического тестирования в фирме Lilly и относящееся к группе ингибиторов некоторых редуктаз (в частности, дигидрофолатре-дуктазы) [47]. Гидрохлорид соединения 3 находится на предклинической стадии испытаний в японской фирмой Kyowa Накка [48].
Производное тиофен-2-сульфодиазепина 4 также относится к группе ингибиторов. Его действие направлено на подавление действия сигналов трансдукционных путей (пути по которым происходит перенос генетической информации) и некоторых ферментов [49]. Структурная сложность представленных соединений диктует и высокие требования к методу их получения. Схемы получения представленных соединений включают большое количество стадий. Для получения 2 описан пятистадийный синтез, а в качестве источника тиофенового цикла предлагается К-(2-бромтиен-5-ил)глутаминовая кислота. Для получения соединения 3 используют 4-бромтиофен-2-карбальдегид с последующей модификацией в одиннадцать стадий. Получение 4 связано с применением на третьей стадии синтеза тиофен-2-сульфохлорида. При анализе литературных данных по синтезу онкопрепаратов отмечается следующая особенность: если синтез производится из достаточно простых исходных веществ, то он многостадийный (восемь и более стадий); если синтез осуществляется в сравнительно небольшое число превращений, то происходит он на основе химически сложных соединений (часто получение которых также требует многостадийного процесса).
Одним из перспективных направлений в фармохимии является синтез биологически активных соединений, действие которых направлено на лечение симптомов СПИДа (Синдрома приобретённого иммунодефицита).
Однако примеров таких соединений среди производных тиофена в настоящее время имеется сравнительно мало (рис.7). Соединение 1 (рис.7) проходит стадию биотестирования по механизму ингибирования некоторых видов транскриптаз и как анти-HIV агент [50]. Фирма CSIC предложила качестве противоинфекционных средств для больных СПИДом несколько модификаций соединения 2 (рис.7). Различия наблюдаются в структуре боковых групп - замена атома фтора на хлор, или цианогруппы на фенильный радикал [51].
(Тиофен-2-сульфониламино)карбоновые кислоты на основе линейных алифатических аминокислот
На основании представленных спектральных данных очевидно, что для 6а сигнал 2,45 м.д. на ЯМР Н спектре и соответствующий ему сигнал 28,78 м.д. на ЯМР 13С спектре могут рассматриваться как сигналы метиленовой группы, связанной с сульфогруппой. Соответственно, сигнал протона 3,56 м.д. и сигнал углерода 52,62 м.д. являются сигналами метиленовой группы, связанной с карбонильной группой.
Хлорангидриды 5а,б могут рассматриваться не только как исходные соединения для получения комбинаторных библиотек структурных аналогов-амидов типа 6-10, но и как исходные для иных вариантов структурной оптимизации (2-тиеносульфонил)пропановых кислот. В частности, вызывает интерес возможность разнообразия данного хемотипа путём введения линейного аминокислотного фрагмента с сохранением в новой структуре активной функциональной группы. В связи с этим, нами изучено взаимодействие хло-рангидрида 5а с п-аминобензойной кислотой (схема 29). Установлено, что данная реакция гладко протекает в ДМФА при температуре 70 С.
Полученная 4-[3-(тиофен-2-сульфонил)пропаноил]аминобензойная кислота 11 легко выделяется в виде осадка из водно-органической среды с выходом 62% (после кристаллизации). Свободная карбоксильная группа в кислоте 11 может также считаться потенциальным реакционным центром для амидного синтеза, приводящего к получению оригинальных структур, содержащих тиофеновый, сульфалкановый и аминокислотный фрагменты. Подобное сочетание структурных мотивов, с одной стороны, может свидетельствовать о потенциально широком спектре биологического действия этого соединения и его производных. Однако, с другой стороны, исходя из представлений концепции "сходство с лидерами", дальнейшее усложнение кислоты 11 может проводиться в весьма ограниченных пределах вследствие её большой молекулярной массы (339 Дальтон). Это обстоятельство является характерным примером того, как определённые свойства потенциальных соединений-лидеров могут приводить к ограничениям при виртуальном отборе его производных для биологического тестирования.
Вместе с тем, положительный результат синтеза 11 говорит о возможности более широкого использования (тиофен-2-сульфонил)пропановых кислот 4а,б в синтезе биоактивных производных тиофена, поскольку известно, что наличие аминокислотных фрагментов в структуре лиганда значительно усиливает эффект сродства (структурного подобия) при взаимодействия лиганда с биомишенью. Кроме того, очевидно, что границы применимости представленных в данном разделе схем получения кислот общих формул 4 и 11 и их производных могут быть существенно расширены за счёт использования иных тиофенсульфохлоридов, варьирования непредельных алифатических кислот (метакриловая, коричная, кротоновая и т.п.) и аминов на стадии комбинаторного синтеза.
Подробные методики получения, выделения, очистки, а также ЯМР !Н - идентификация соединений 2-11, описанных в данном разделе, представлены в Экспериментальной части (разд. 3.2, 3.4).
В предыдущем разделе описаны синтез и строение новых соединений -(тиофен-2-сульфонил)пропановых кислот и их амидных производных. Представленные результаты являются примером получения и описания структур, в своей основной массе удовлетворяющих требованиям концепции "сходство с лидерами", благодаря чему данные соединения могут рассматриваться как перспективные кандидаты для испытаний на биологическую активность. В данном разделе предлагается ещё один подход к синтезу производных 2 тиофенсульфохлорида. Он заключается в получении широкого круга (тио-фен-2-сульфониламино)карбоновых кислот общих формул 12-14 (схема 30) на основе линейных алифатических аминокислот, сложных эфиров аминокислот гетероциклического строения и п-аминобензойной кислоты. Наш выбор данного направления синтеза был продиктован, с одной стороны, огромной значимостью сульфаниламидных препаратов на фармацевтическом рынке, и с другой, отсутствием соединений подобного рода в открытых базах данных ведущих производителей химического разнообразия, в крупнейших информационных электронных базах данных [96,97] и в открытой печати. Данные соединения могут рассматриваться как исходные билдинг-блоки для генерирования достаточно больших комбинаторных библиотек структурных аналогов - амидов
Методы аналитического контроля
Выполненный виртуальный анализ ряда новых производных тиофена и 2-бромтиофена (разд. 2.2) показал степень влияния разнообразных фрагментов на значения основных физико-химических дескрипторов этих соединений. Результаты, полученные при проведении виртуального анализа, могут рассматриваться как визуально удобные и объективные рекомендации для планирования целенаправленного синтеза новых соединений, предназначен ных для первичного биологического тестирования на определённый вид активности.
Дальнейший виртуальный отбор новых соединений для синтеза и первичного биологического тестирования включал два этапа. На первом этапе сгенерированная нами база (9100 соединений) амидных производных (тио-фен-2-сульфонил)пропановых кислот 4а,б, 11 (разд. 2.1.1) и (тиофен-2-сульфониламино)карбоновых кислот 12-14 (разд. 2.1.2) проходила процедуру "фильтрования", в результате которой отсеивались соединения, имеющие неблагоприятный набор значений основных физико-химических дескрипторов (более двух дескипторов не удовлетворяют требованиям концепции "сходство с лидерами") или ярко выраженное неблагоприятное влияние строения определённого фрагмента (фрагмента, связанного с сульфогруппой, аминокислотного фрагмента или аминного остатка в амидном фрагменте) на какой-либо конкретный дескриптор. В результате исходная виртуальная база была сокращена до 2971 соединения. На втором этапе виртуального отбора был использован принцип максимально разнообразной выборки соединений из имеющейся общей виртуальной базы тиофеновых производных. Подобный подход является наиболее употребительным в целях рационального отбора соединений для биологических тестов. В рамках отдельных виртуальных библиотек (соответствующих определённой исходной кислоте), все соединения, прошедшие первый этап отбора, были отсортированы в порядке уменьшения структурного разнообразия при помощи специального компьютерного алгоритма, реализованного в модуле Diversity (от англ. - разнообразие) программы ChemoSoft (Chemical Diversity Labs, Inc., 2003) [118]. Данный алгоритм позволяет "дробить" молекулу на структурные фрагменты (до трёх связей) и сравнивать их со структурными фрагментами других молекул, выявляя при этом однообразные - разнообразные фрагменты и выстраивая корреляционные зависимости в порядке уменьшения разнообразия. После выполнения процедуры сортировки были отобраны первые 5-10% соединений (с мак симальным структурным отличием) в пределах каждой комбинаторной библиотеки.
Таким образом, из каждой комбинаторной серии были отобраны наиболее репрезентативные и разнообразные соединения. В результате проведения этих процедур мы получили суммарную библиотеку, состоящую из 162 амидных производных изучаемых кислот. В неё вошли также 5 амидных производных, синтез которых был описан ранее, в разделе 2.1 (86, 16в, 16к, 17д, 18г).
2.3.2 Синтез отобранных соединений и результаты испытаний Синтез амидов (26-182), отобранных для биологического тестировани-ия (разд. 2.3.1) проводили на основании схем синтеза, представленных в разделе 2.1. В результате целенаправленного синтеза получили 19 соединений -производных кислот 4а,б (26-44), 2 амида кислоты 11 (45-46), 96 соединений общей формулы 16 (47-142), 36 соединений общей формулы 17 (143-178) и 4 амида общей формулы 18 (179-182).
Все синтезированные новые производные тиофена и 2-бромтиофена (162 соединения) были протестированы на проявление ингибиторной активности по отношению к Нер-2 линии опухолевых клеток. Биологические испытания были осуществлены на фирме ООО "Предприятие Контакт-Сервис" (г. Долгопрудный, Московская обл.). Скрининг осуществлялся методом in vitro на проявление цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. Методика теста на цитотоксичность заключается в выдерживании клеточной линии 24 часа в среде тестируемого вещества определённой концентрации, дальнейшем выращивании культуры в течение двух дней при 37 С и последующей последовательной обработкой клеток культуры этанолом, определённым красителем и раствором сульфата додецила натрия. Потом каждый полученный адсорбированный раствор был прочитан на спектрофотометре (585 нм), и выявлены концентрации веществ, при которых прекращается рост и наступает гибель опухолевых клеток.
