Содержание к диссертации
Введение
2. Методы конформационного анализа углеводов 6
2.1 Введение 6
2.2 Общие положения конформационного анализа углеводов 7
2.3 Обзор силовых полей, применяющихся для конформационного анализа углеводов 7
2.4 Применение методов квантовой механики для моделирования конформаций углеводов 21
2.5 Сопоставление методов молекулярной и квантовой механики 27
2.6 Методы изучения конформационного равновесия 28
2.7 Молекулярная динамика (МД) 33
2.8 Особенности моделирования углеводов в растворах 37
2.9 Исследования ионных углеводных структур 42
2.10 Практически полезные результаты, которые можно получить методами теоретического моделирования углеводов 43
2.11 Заключение 44
3. Обсуждение результатов 45
3.1 Исследованные структуры 45
3.2 Конформационный анализ а-(13)-связи в дисахаридах 46
3.3 Конформационный анализ а-(13)-связи в линейных трисахаридах 61
3.4 Конформационный анализ соединений, содержащих а-(1 2)-фукозидную связь 72
2 3.4 Конформационный анализ соединений, содержащих чередующиеся а-(1—>3) и а-( 1->4) связи 83
3.5. Конформационный анализ соединений, содержащих 2-О-сульфатную группу.
87
Выводы 93
Список Литературы 94
- Общие положения конформационного анализа углеводов
- Молекулярная динамика (МД)
- Конформационный анализ а-(13)-связи в дисахаридах
- Конформационный анализ соединений, содержащих а-(1 2)-фукозидную связь
Введение к работе
Актуальность данной работы определяется фундаментальной задачей современной химии природных соединений, состоящей в выявлении взаимосвязи структуры и свойств природных макромолекул, в частности, природных полисахаридов.
Фукоиданы представляют собой класс природных полисахаридов, встречающихся в морских беспозвоночных, а так же в водорослях. Они построены преимущественно из остатков a-L-фукозы, и могут иметь нерегулярные разветвления. Для фукоиданов характерна высокая степень сульфатирования, при этом сульфатные группы в цепи молекулы также могут располагаться нерегулярно. Несмотря на то, что эти биополимеры известны уже несколько десятков лет, имеются лишь фрагментарные сведения об их структуре. Это вызвано тем, что установление структуры фукоиданов классическими методами часто бывает затруднено вследствие их высокой лабильности.
Для фукоиданов характерна разнообразная физиологическая активность, в частности: противоопухолевая [1], антикоагулянтная [2] и антивирусная [3]. Наличие такой активности связано с тем, что эти биополимеры способны мимикрировать углеводные лиганды природных рецепторов, например, белков селектинов. При этом способность к мимикрированию очевидно определяется конформацией полимерной цепи. Для выяснения особенностей конформационного поведения фукозидной связи в данной работе проведено систематическое изучение синтетических олигофукозидов, представляющих наиболее характерные структурные фрагменты природных фукоиданов. Изучение проводилось как с использованием методов теоретического молекулярного моделирования, так и ЯМР экспериментов', Другой целью работы являлась систематизация спектральных (ЯМР 13С) эффектов
1 Эксперименты по ЯМР проводились А.А. Грачевым (лаборатория химии гликоконъюгатов, ИОХ РАН).
сульфатирования и гликозилирования для фукозидов и их объяснение в свете результатов теоретического конформационного анализа. В дальнейшем эти эффекты могут быть использованы при установлении структуры природных фукоиданов по данным ЯМР 13С.
2. МЕТОДЫ
Общие положения конформационного анализа углеводов
Одна из ветвей теоретического конформационного анализа связана с представлением о молекуле как о механической системе, в которой атомы рассматриваются в виде точечных масс. Такая модель основывается на приближении Борна — Оппенгеймера, согласно которому потенциальная энергия молекулы с хорошей точностью описывается непрерывной функцией координат ядер. Основы этого направления молекулярного моделирования были заложены Хиллом [4], Уэстхаймером [5] и Китайгородским [6]. По идее авторов, химические связи характеризуются некоторыми «естественными» длинами и валентными углами, а конформации реальных молекул устанавливаются такими, чтобы по возможности сохранить эти величины. Стерические эффекты моделируются ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями. Если система напряжена, то молекула деформируется в предсказуемом направлении согласно градиенту энергии «напряжения», и эта деформация может быть рассчитана. Этот метод называется молекулярной механикой, подробно его теория изложена в монографии [7]. Молекулярная механика относится к группе эмпирических методов. В ней используется понятие силового поля, которое представляет собой набор уравнений, описывающих изменения энергии молекулы при отклонении ее геометрии от «идеальной», и параметров, входящих в эти уравнения. Эти параметры являются эмпирическими и могут быть найдены путем калибровки при сопоставлении расчетных данных с экспериментальными результатами, или же под результаты расчета методом более высокого уровня теории -неэмпирическим или полуэмпирическим.
В данном обзоре вначале рассматривается применение методов молекулярной механики для конформационного углеводов, а затем так же обсуждается использование методов более высокого уровня теории. 2.2 Общие положения конформационного анализа углеводов. Впервые термин «конформационные свойства гликозидной связи» был введен в пионерской работе Лемье и Кото [8], которые изучали углеводы с агликоном неуглеводной природы с помощью спектроскопии С-ЯМР, оптических методов и конформационных расчетов. Для описания конформации гликозидной связи используются торсионные углы, описывающие вращение вокруг связей Ci-Oi и Сх-Ох. Они обозначаются символами ф и \/ соответственно (Рис. 1). В результате своих исследований Лемье и Кото пришли к выводу, что в случае объемных агликонов (циклогексила и его производных) преимущественной является гош-ориентация агликона по отношению к связи С1-05 углеводного остатка, т.е. модуль угла ф практически равен 60. В этой работе была также предпринята попытка связать значения химических сдвигов 13С с другим параметром гликозидной связи - величиной угла ці. Исторически молекулярная механика была первой из групп методов, использовавшихся для моделирования конформации гликозидных связей. В качестве источников экспериментальных данных наиболее часто используется спектроскопия ЯМР (для жидкой фазы) или кристаллография (для твердой фазы). Для конформационного анализа углеводов было предложено большое количество силовых полей, которые с тем или иным успехом использовались или используются до сих пор. Ниже мы подробнее рассмотрим эту тему. 2.3 Обзор силовых полей, применяющихся для конформационного анализа углеводов. Силовые поля, использующиеся в конформационном анализе углеводов можно разделить на две большие группы [9]. К первой относятся те, что используют так называемое приближение «жестких моносахаридных звеньев».
Их появление и широкое распространение в свое время было обусловлено невысоким уровнем развития компьютерной техники, что вынуждало сводить все вычисления к возможному разумному минимуму. В данной группе силовых полей учитываются лишь Ван-дер-Вальсовы взаимодействия между гликозидными остатками, а непосредственно для гликозидной связи вводится дополнительный терм, отвечающий за так называемый экзоаномерный эффект, т.е., дополнительное невалентное взаимодействие атома кислорода гликозидной связи с атомом кислорода в цикле (Рис. 2) Конформации самих углеводных циклов (а иногда и гидроксильных заместителей) в данном приближении считаются неизменными. В англоязычной литературе эта группа силовых полей получила название Hard Spheres Plus Exo-Anomeric Effect, и обозначается аббревиатурой HSEA [10, 11]. Следует обратить внимание, что в силовых полях этой группы не учитывались электростатические взаимодействия, вследствие чего было невозможно корректное моделирование влияния растворителя или образования водородных связей. Кроме того, отсутствие учета возможных искажений конформации гликозидного кольца делало невозможным использование силовых полей HSEA в молекулярно-динамических симуляциях (подробнее о молекулярной динамике будет рассказано ниже). Для преодоления данного ограничения при использовании силовых полей HSEA применялся так называемый алгоритм Монте-Карло [12, 13]. Этот алгоритм с успехом использовался для моделирования характеристик ЯМР олигосахаридов до середины 90-ых годов, в частности, он входил в состав программного продукта GEGOP (GEometry of Glycoproteins). Примеры использования метода Монте-Карло можно найти в работах [14-17]. С помощью силовых полей HSEA было проведено достаточно много расчетов и часто результаты удовлетворительно совпадали с экспериментальными данными ЯМР. Из самых значительных работ, в которых использовались силовые поля HSEA, следует, в первую очередь, назвать работы Лемье [8, 18].
Интересно отметить, что еще в начале 90-ых годов встречались работы, использующие силовое поле HSEA, например [14], но, из-за возрастающей сложности исследуемых объектов (в цитируемой работе речь идет о конформационном анализе двухзарядных дисахаридов) авторам приходилось делать искусственные допущения. В настоящее время, в связи с увеличением производительности вычислительной техники, более продуктивным является использование силовых полей, относящихся к другой группе. В них уже включена возможность учета электростатических взаимодействий, образования водородных связей, изменения конформации гликозидных колец, с сохранением при этом учета экзоаномерного эффекта. Подробности можно найти в обзоре Вудса [9], в котором рекомендовано относить к данной группе только силовые поля, предназначенные в первую очередь для расчета конформации макромолекул (биополимеров), и позднее адаптированные для конформационного анализа углеводов, такие как AMBER [20-22], CHARMm [23, 24] и GROMOS [25]. Так же в эту группу Вудом включаются силовые поля TRIPOS [26, 27] и CVFF [28]. Особо Вуд выделяет силовые поля ММ2 [29] и ММЗ [30], мотивируя это более сложным видом потенциалов, описывающих деформации связей, наличием так называемых «перекрестных термов» ("cross terms"), а так же некоторыми особенностями в учете этими силовыми полями электростатических взаимодействий. В самом деле, во время написания цитируемого обзора обычной практикой для силовых полей ММ2 и ММЗ при моделировании электростатических взаимодействий было использование приближения взаимодействия связевых диполей, тогда как все остальные перечисленные выше силовые поля используют заряд-зарядовые взаимодействия. При этом заряды, как правило, являются неотъемлимой встроенной частью таких силовых полей, как AMBER, GROMOS, TRIPOS и другие, в то время как в силовых полях ММ2/3 можно использовать заряды, взятые из внешних источников, например, из квантово-механических расчетов.
Молекулярная динамика (МД)
Помимо систематического сканирования торсионных углов, существует еще один способ для исследования ППЭ. Он заключается в численном интегрировании уравнений движения молекул (как движения молекулы в целом, так и внутреннего движения). Теоретически, такое движение должно отвечать реальной динамике молекулы, поэтому данный подход получил название молекулярная динамика (МД) [102]. Задачей экспериментатора в этом случае является правильный выбор длины траектории МД и шага по времени: слишком большие величины шагов приводят к нереалистичным результатам, слишком маленькие увеличивают время расчета, при этом практически не влияя на практическую адекватность симуляции. С длинами траекторий ситуация другая - они должны быть как можно больше, но, с другой стороны это требует увеличения времени расчета. В работе [103] можно найти описание влияния длины траектории на результат молекулярно-динамического эксперимента. Были исследованы энергии образования комплексов а-пиненов с а-циклодесктрином и показано, что для корректного воспроизведет! энергий межмолекулярного взаимодействия в этом случае необходимы времена симуляции существенно превышающие 2 не. Несмотря на то, что для реалистичных симуляций требуется сильно большее время расчета, чем для сканирования торсионных углов, этот подход уже очень давно привлекает внимание исследователей, занимающихся конформационным анализом углеводов. В первую очередь это произошло потому, что, как уже было сказано, он может описывать движение молекулы как единого целого, а значит, возможно, открывается путь к расчетам многомолекулярных систем, например, углеводов в растворах, или в комплексах с природными рецепторами. Это обстоятельство является чрезвычайно важным для исследования природных полисахаридов, конформации которых интересно знать в первую очередь в водных средах. Существует много работ, посвященных данной тематике, например [46, 104-112]. Простые олигосахариды так же часто исследовались с помощью МД [15,113-119]. В большинстве из отмеченных выше ссылок при учете влияния растворителя речь идет о включении молекул воды в расчет в явном виде. Существует иной способ моделирования конденсированной фазы (реальные газы, разбавленные растворы, и т.п.). Он является разновидностью молекулярной динамики и носит название стохастической динамики.
Его основным уравнением является уравнение Ланжевена [120]: где х - координата частицы с массой m, t - время, F(t) - так называемая «систематическая» сила, С, - коэффициент фрикции, R(t) - случайная сила. Без последних двух слагаемых это уравнение фактически является уравнением молекулярной динамики. Коэффициент фрикции моделирует присутствие вязкости в среде, а случайная сила R - стохастические столкновения с другими частицами. Примеров применения стохастической динамики для конформационного анализа углеводов несколько меньше. В основном, они тоже связаны с моделированием фрагментов бактериальных полисахаридов [17, 46, 114, 117, 121, 122]. Еще одна разновидность молекулярной динамики носит в англо-язычной литературе название "annealing" («закалка»). Поскольку МД пытается описать реальное движение молекулы, очевидно, что должна присутствовать зависимость от температуры. В стандартных молекулярно-динамических протоколах используется режим постоянной температуры. В случае описываемого варианта динамики вначале моделируется разогрев системы до определенной температуры. В результате появляется возможность пересечения энергетических барьеров, недоступных при обычной температуре. Пример использования такого подхода для конформационного анализа углеводов можно найти в [123, 124]. В этих работах проводилось изучение конформаций Р-(1— 4)-связанного димера N-ацетилглюкозамина и фрагментов РНК. Во всех цитированных выше работах стандартная процедура верификации результатов молекулярно-динамического эксперимента состоит в вычислении усредненных по ансамблю конформеров величин ЯЭО, констант спин-спинового взаимодействия. Возможно усреднение энергии межмолекулярного взаимодействия, что обуславливает принципиалыгую применимость данной методики для моделирования таких свойств углеводов, как способность связываться с природными рецепторами преимущественно белковой природы. В реальности методом МД можно достоверно моделировать взаимодействие лишь небольших молекул [103]. Следует обратить внимание на то, что в данном случае усреднение происходит по времени, а не по энергиям, как при вычислении характеристик углеводов из конформационных карт, построенных систематическим сканированием торсионных углов. При проведении расчета лишь предполагается, что частота, с которой в молекулярно-динамической траектории будет встречаться та или иная конформация, пропорциональна Больцмановскому фактору.
Предположение это требует, чтобы система находилась в состоянии термодинамического равновесия. Для того чтобы можно было обоснованно утверждать, что система именно такова, нужно выполнение одного из двух условий: а) высокая температура, обеспечивающая быстрое усреднение; б) достаточно долгое время симуляции. Первый вариант не всегда подходит, так как повышение температуры само по себе может изменять положение равновесия. Второй вариант требует, как можно понять, увеличения времени расчета. При проведении молекулярно-динамических расчетов может возникнуть необходимость в визуализации полученных результатов по типу того, как это делается при построении конформационных карт. В данном случае на карте будут присутствовать скопления точек в областях, являющихся конформационно предпочтительными для исследуемой молекулы (Рис. 25).
Конформационный анализ а-(13)-связи в дисахаридах
В данном разделе обсуждается изучение а-(1—»3)-фукозидной связи и влияния сульфатирования на ее конформацию на примере серии дифукозидов 1--3. Для изучения спектральных эффектов сульфатирования и гликозилирования здесь обсуждаются так же моносахариды 5 и 6. Данные спектров ЯМР соединений 1-3 и 5, 6. В Таблицах 1—3 представлены данные по химическим сдвигам ЯМР 13С и н для сульфатированных соединений 1, 2 и 4 и их несульфатированных предшественников 3 и 5, а также внутрициклические константы спин-спинового взаимодействия Н- Н. Отнесение сигналов !Н к структуре было сделано на основании данных экспериментов Н- Н COSY и 2D TOCSY. Сигналы ЯМР 13С были отнесены на основании данных 2D !H-I3C HMQC экспериментов. Таблица 1. Химические сдвиги Н ЯМРа и константы спин-спинового взаимодействия (Гц) для соединений 1-3 и 5, 6. внутреннего стандарта.
Сигналы пропильного агликона: ОСН2СН2С#з 8 0.92; Влияние сульфатирования на сдвиги ЯМР 13С исследуемых соединений выяснялось измерением так называемых эффектов сульфатирования (А6), которые представляют собой разницу соответствующих химических сдвигов сульфатированного и несульфатированного соединения. Как и следовало ожидать, наиболее значительный положительный эффект сульфатирования наблюдался на атомах С-4, непосредственно связанных с сульфатированным атомом кислорода. В то же время обращает на себя внимание то, что эффекты сульфатирования на атомах С-4 в дисахариде 1 и в восстанавливающем остатке дисахарида 2 приблизительно на 2 м.д. превосходят соответствующие эффекты в моносахариде 5. (Таблица 3) Так же видно, что в дисахаридах 1 и 2 проявляется значительный положительный эффект на атоме С-Г, отсутствующий в моносахариде 6. На атоме С-3 в моносахариде 6 закономерно обнаруживается небольшой отрицательный эффект сульфатирования, так называемый р-эффект [138]. В восстанавливающем остатке дисахарида 2 подобный Р-эффект отсутствует, и более того, эффект сульфатирования на атоме С-3 положительный. Все эти изменения эффектов сульфатирования в дисахаридах по сравнению с моносахаридом, на наш взгляд имели конформационную природу, и мы рассчитывали объяснить их при помощи результатов теоретического конформационного анализа. Конформационное исследование соединений 1—3. Поскольку данные соединения были первыми из исследованных нами в данной работе, на их примере мы отрабатывали методики как конформационных расчетов, так и ЯМР экспериментов. В качестве первого приближения нами была применена процедура так называемого сканирования торсионных углов ф и \/ с использованием силового поля ММЗ. Это процедура заключается в последовательном переборе значений торсионных углов из заданного диапазона с некоторым шагом. При этом в каждой точке проводится оптимизация геометрии, в которой значения сканируемых торсионных углов фиксируются. Диэлектрическая проницаемость, использованная нами при расчетах, равнялась 81, молекулы растворителя мы в явном виде не учитывали, сульфатные группы рассматривались как анионы, противоионы в расчете отсутствовали.
Параметры для сульфатных групп были взяты из работы [139]. Диапазон сканирования торсионных углов составлял -180-Ч80 по каждому углу с шагом 10. Полученные таким образом конформационные карты приведены на Рис. 1. Для подтверждения адекватности проведенных расчетов в данной работе мы везде использовали данные экспериментов по ядерному эффекту Оверхаузера (ЯЭО) на ядрах JH. Величины ЯЭО могут быть измерены в двух модификациях - равновесной или неравновесной. Величины равновесного ЯЭО являются функцией всех межпротонных расстояний в молекуле, и таким образом, даже небольшие изменения в конформации молекулы сказываются на них существенно. В условиях этого эксперимента так же можно наблюдать дальние эффекты ЯЭО, а их знак позволяет судить о взаимном расположении протонов. (Рис. 2) Кроме того, чувствительность эксперимента по равновесному ЯЭО весьма высока. Серьезным недостатком этой методики является то, что она требует предварительного селективного облучения одной из линий резонанса в спектре ЯМР 1Н. Таким образом, методика измерения равновесного ЯЭО может быть с успехом использована лишь для молекул с достаточно хорошо разрешенными спектрами !Н. Тем не менее, первоначально для экспериментального исследования соединений 1-3 мы использовали именно ее, так как в протонных спектрах всех этих дисахаридов сигнал протона Н- хорошо разрешен от остальных сигналов и мог быть селективно предоблучен. Пример спектра равновесного ЯЭО для соединения 1 приведен на Рис.
Конформационный анализ соединений, содержащих а-(1 2)-фукозидную связь
В данном разделе описан конформационный анализ трех дисахаридов содержащих а-(1— -2)-фукозидную связь, различающихся присутствием сульфатных групп (10-12), а так же анализ серии сульфатированных и несульфатированных трисахаридов, содержащих 2,3-разветвление (13-16). Данные спектров ЯМР !Н- и 13С соединений 10-16 представлены в Таблицах 15 и 16. Методика проведения молекулярно-механических расчетов с использованием силового поля ММЗ была аналогична уже применявшейся в случае исследованных нами ранее фрагментов фукоиданов. Квантово-механические расчеты проводились при помощи программы Priroda [143], с шагом 10 по каждой координате, как и при расчетах с использованием силового поля ММЗ, но используемый при этом диапазон значений ф и vj/ составлял 0+70 и -70ч-80, соответственно. Этот интервал был выбран для сканирования, так как из молекулярно-механических расчетов было известно, что доля конформеров, лежащих вне его пренебрежимо мала, и, таким образом, проводить сканирование всей конформационной карты, что в случае квантово-механических расчетов занимает много времени, было нецелесообразно. Кроме теоретических расчетов, конформации олигосахаридов 10-16 исследовались также с привлечением экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера (ЯЭО). Сопоставление экспериментальных величин ЯЭО и величин, рассчитанных на основании теоретически предсказанного (ММЗ) распределения конформеров, использовано нами в качестве контроля корректности теоретических расчетов. Расчет величин ЯЭО проводился, как описано ранее. Спектры зарегистрированы при 30C в D20 с использованием ацетона (8 2.25 м.д.) в качестве стандарта. Сигналы пропильного агликона: ОСН2СН2СЯз 0.92 м.д.; ОСН2СЯ2СН3 1.62-1.64 м.д.; ОСЯ2СН2СН3 3.49-3.65 и 3.62-3.84 м.д.
В отличие от исследовавшихся ранее олигофукозидов, в случае (1- 2)-связанных дисахаридов 10-12 молекулярно-механические расчеты по методу ММЗ приводили к результатам, существенно отличающимся от экспериментальных данных (Таблица 17). Так, для величин ЯЭО на протоне НГ нами были получены завышенные значения. Это указывало на то, что молекулярная механика ошибочно предсказывает, что конформер со сближенными протонами HI и НГ (Рис. 10), является доминирующим. Расчетные данные приведены для дианиона с недиссоциированной сульфатной группой в бис-гликозилированном звене. бТрианион с диссоциированными сульфатными группами. вДианион с недиссоциированной сульфатной группой в остатке фукозы при 02. гДианион с недиссоциированной сульфатной группой в остатке фукозы при ОЗ. Дисахариды 10-12 содержат 1,2-псевдоразветвление, благодаря вицинальному расположению пропильного агликона и присоединенного через (1-»2)-связь фукозного остатка. Отметим, что молекулярная механика корректно описывает конформационное распределение вокруг гликозидной связи, несущей пропильный агликон. Из данных расчетов следовало, что ОСН2-группа агликона находится преимущественно в конформации, показанной на Рис. 11. В такой конформации должен наблюдаться значительный ЯЭО между протоном HI и одним из протонов метиленовой группы (На), и заметно меньший ЯЭО между протоном Ній вторым метиленовым протоном (НЬ). При этом между протоном НЬ и протоном Н5 пиранозного кольца также должен наблюдаться ЯЭО, но в несколько раз меньший по величине. Экспериментально все эти эффекты были зафиксированы: соотношение ЯЭО На/Hi к НМЛ и Н6/Н1 к Ш/Н5 в случае дисахаридов 10-12 составляло 2:1 и 1:2-5-1:4. На основании полученных данных можно было предположить, что расхождение между экспериментальными и рассчитанными величинами ЯЭО связаны с некорректностью описания молекулярной механикой распределения конформеров вокруг (1- 2)-связи. Для дальнейшего исследования этой проблемы мы провели расчеты также 3,4-разветвленного трифукозида 17. В этом соединении, как и в дисахаридах 10-12, представлено вицинальное аксиально-экваториальное дизамещение, при этом для (1- 3)-связанного фукобиозидного звена наблюдается стереохимическая ситуация, подобная таковой для (1— 2)-связанного звена в дисахаридах 10-12.
Расчеты конформации трисахарида 17 по методу ММЗ привели к результатам, удовлетворительно совпадающим с экспериментальными данными (Таблица 17). Из таблицы видно, что присутствие остатка фукозы в положении 04 приводит к возрастанию относительного ЯЭО на протоне НЗ. По аналогии, в случае (1—»2)-связи это должно было бы вызывать увеличение ЯЭО на протоне Н2, что и наблюдается экспериментально, но не наблюдается в расчете. По нашему мнению, это может означать, что молекулярная механика неправильно описывает (1- 2)-гликозидную связь в присутствии пропильного агликона, который вызывает меньшие стерические затруднения, чем остаток фукозы. Поэтому для конформационного анализа соединений 10-12 нами был использован метод функционала плотности (ФП), являющийся методом более высокого уровня теории. Рассчитанные по методу ФП теоретические и экспериментальные величины ЯЭО совпадали (Таблица 18), то есть метод ФП корректно описывает конформацию (1-»2)-связи. Анализ величин ЯЭО показал, что в отличие от исследовавшихся нами ранее (1- 3)-связанных дифукозидов, в ряду (1- 2)-связанных дифукозидов не происходит таких сильных конформационных изменений при введении сульфатной группы в 04. Это связано с пространственной удаленностью сульфатной группы при С4 и (1- 2)-связи.