Введение к работе
Актуальность проблемы. Высокий уровень заболеваемости эхинококкозом является серьезной экологической и медико-социальной проблемой для многих стран с разными природно-климатическими и социально экономическими условиями [Daneshbod Y., 2004; Oudni M. et al., 2004; Hashemitabar G.R. et al., 2005; Sapkas G.S. et al., 2006; Varcasia A. et al., 2007], в том числе и для ряда регионов Российской Федерации, к которым относится и Южный Урал [Бессонов А.С., 2001]. За последние пять лет показатель заболеваемости эхинококкозом в России увеличился в 3 раза, при этом в структуре заболевших 14,4% составляли дети, что свидетельствует об интенсивности передачи инвазии и неэффективности проводимых мероприятий [Онищенко Г.Г., 2006]. В Республике Башкортостан за последние десять лет количество детей и подростков, больных эхинококкозом, возросло в 5 раз [Гумеров А.А. и др., 2006; Шангареева Р.Х. и др., 2006]. Эти факты диктуют необходимость разработки новых подходов в профилактике эхинококкозов.
Важнейшим звеном в решении проблемы является типирование таксономической принадлежности возбудителя заболевания. Немаловажное значение в эпидемиологии и эпизоотологии эхинококкозов имеют биологические отличия изолятов Echinococcus из разных паразитарных систем [Коваленко Ф.П., 1998; Thompson R.C., McManus D.P., 2002]. Использование методов молекулярной биологии позволило дифференцировать десять внутривидовых вариантов (штаммов, генотипов, биоваров) E. granulosus: G1 – «общий, домашних овец»; G2 – «тасманийских овец»; G3 – «буйволов»; G4 – «лошадей»; G5 – «крупного рогатого скота»; G6 – «верблюдов»; G7 – «свиней»; G8 – «северных оленей»; G9 – «человека»; G10 – «Fennoscandian cervid» [Bowles J. et al., 1992; 1995; Bowles J., McManus D.P. 1993; Scott J.C. et al. 1997; McManus D.P., 2002; Kamenetzky L. et al., 2002; Lavikainen A. et al. 2003]. Важная биолого-эпидемиологическая особенность штаммов E. granulosus – их неодинаковая инвазивность для человека [Ястреб В.Б., Скворцова Ф.К., 1990; McManus D.P. et al., 1994; Bart J. et al., 2006]. Большинство исследователей считают человека наиболее восприимчивым к овечьему штамму с генотипом G1 [McManus D.P. et al., 1994; Thompson R.C., McManus D.P., 2002; Dinkel A. et al., 2004; Bart J. et al., 2006]. Хотя описаны случаи инвазии и другими штаммами, например, в Аргентине у 42% больных гидатидозным эхинококкозом людей были идентифицированы штаммы G2, G5 и G6 [Naidich A. et al., 2006]. В литературе не описано ни одного случая инвазии человека E. equinus (штамм G4). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.
Определение у E. granulosus внутривидового полиморфизма имеет огромное практическое значение для совершенствования мероприятий по снижению уровня заболеваемости эхинококкозом [McManus D.P., Thompson R.C., 2003]. В настоящее время во многих странах ученые ведут поиск эффективных диагностических тестов и профилактических вакцин против ларвальных цестодозов, в том числе эхинококковых гидатидозов, для разработки которых необходимо типирование штаммовой принадлежности и определение популяционной индивидуальности возбудителя [Озерецковская Н.Н., 2001; Одоевская И.М., 2007; Arend A.C. et al., 2004; Carmena D. et al., 2006; Muzulin P.M. et al., 2007]. В Республике Башкортостан подобные исследования ранее не проводились. Очевидно, что для характеристики эпидемиологической ситуации в Южно-Уральском регионе необходимо располагать данными о структуре популяций E. granulosus.
Определенные трудности в профилактике гидатидозного эхинококкоза создает недостаточность сведений об индивидуальной восприимчивости человека к штаммам E. granulosus. Считается, что клиническая реализация эхинококковой инвазии происходит менее чем у 1% людей [Тумольская Н.И., 1992]. Известны случаи бессимптомного течения эхинококковой болезни или со слабо выраженными симптомами, которые заканчивались полным выздоровлением [Журавец А.К., 2004].
К числу наиболее актуальных аспектов проблемы эхинококкозов относятся вопросы выявления факторов, влияющих на развитие заболевания, причин возникновения осложнений и рецидивов [Тумольская Н.И., 1992]. Мало изучены механизмы, обусловливающие локализацию эхинококковой кисты в организме человека [Zahawi H.M. et al., 1999].
В последнее время сформулирована концепция, согласно которой характер течения и исход паразитарных заболеваний зависит от предрасполагающих факторов, многие из которых генетически детерминированы [Cooper P.J. et al., 2003; Quinnell R.J., 2003]. В некоторых случаях описывают врожденную, генетически обусловленную, резистентность человека к инвазии гельминтами [Антонов М.М. и др., 2004]. Одним из методов анализа роли генетических факторов в возникновении и развитии заболеваний является исследование ассоциаций с генетическими маркерами, что позволяет определять группы риска, обосновывать индивидуальную профилактику и превентивную терапию [Баранов В.С. и др., 2000]. В этой связи поиск генов-кандидатов индивидуальной восприимчивости человека к эхинококкозу представляется актуальной задачей, которая позволит глубже проникнуть в фундаментальные механизмы патогенеза этой болезни, и будет способствовать совершенствованию профилактических мероприятий.
Цель исследований:
Идентифицировать таксономическую принадлежность возбудителя эхинококкоза и разработать алгоритм прогнозирования повышенного риска заболевания у детского населения Республики Башкортостан на основании выявления молекулярно-генетических маркеров индивидуальной предрасположенности.
Задачи исследований:
-
Осуществить типирование штаммовой принадлежности возбудителя эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан по морфологическим признакам и генотипической характеристике.
-
Изучить нуклеотидный полиморфизм маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 у изолятов E. granulosus из Южного Урала.
-
Изучить распределение антигенов HLA-A, B класса I у больных гидатидозным эхинококкозом детей в Башкортостане.
-
Установить распределение частот специфичностей HLA генов DRB1 и DQB1 у больных эхинококкозом.
-
Изучить полиморфизм Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 и полиморфизм N/del гена GSTM1 у больных эхинококкозом.
-
Провести анализ ассоциаций полиморфных аллелей и генотипов с вариантами течения эхинококкоза (солитарным, сочетанным, осложненным).
-
Разработать алгоритм прогнозирования повышенного риска гидатидозного эхинококкоза у детского населения Башкортостана на основе анализа молекулярно-генетических маркеров индивидуальной предрасположенности.
Научная новизна работы.
Впервые проведен комплексный анализ таксономической принадлежности возбудителя и восприимчивости к заболеванию населения в очаге гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале.
Проведены исследования генотипа и проанализирован нуклеотидный полиморфизм таксономически значимого маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 у изолятов E. granulosus. На основании полученных результатов установлено, что на территории Южного Урала возбудитель гидатидозного эхинококкоза у населения принадлежит штамму G1 «общий, домашних овец».
Определены условия для амплификации и последующего рестрикционного анализа маркерных фрагментов ДНК гена CO1 для идентификации генотипа G1 у изолятов E. granulosus.
Изучен полиморфизм генов комплекса гистосовместимости (HLA DRB1*, DQB1*) у больных эхинококкозом детей в Башкортостане. Установлена ассоциация специфичностей *03 гена DRB1 и *02 гена DQB1 с высокой степенью риска развития осложнений.
Выявлены маркеры повышенного риска эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан среди полиморфных вариантов генов ферментов детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты. Установлена ассоциация полиморфной аллели G и генотипа *AG гена CYP1А1 с предрасположенностью к заболеванию. Определена ассоциация делеции гена GSTM1 с развитием сочетанного эхинококкоза.
Впервые показано, что генетическое тестирование лиц из эндемичных очагов эхинококкоза позволит выделять группы риска, прогнозировать течение заболевания.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Научно обоснован и предложен комплексный подход к характеристике синантропного очага эхинококкоза, основанный на определении генетической структуры популяции E. granulosus и скрининге полиморфизма генов-кандидатов восприимчивости к заболеванию у человека.
Разработаны и предложены методические основы оценки индивидуальной предрасположенности к гидатидозному эхинококкозу, которые базируются на результатах молекулярно-генетического тестирования маркеров риска.
Предложен и апробирован способ получения маркерных фрагментов ДНК митохондриального гена CO1 и модифицирован метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации генотипа G1 E. granulosus.
Материалы диссертации использованы при подготовке:
-
Методических рекомендаций для медицинских работников и работников ветеринарной медицины.// «Система эпидемиолого-эпизоотологического надзора за эхинококкозами». - Уфа. - 2005. - 48 с.
-
Изобретений:
2.1. Способ прогнозирования сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом у детей / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Комиссарова М.А., Викторова Т.В. (Патент РФ №2307349);
2.2. Способ прогнозирования рецидивов эхинококкоза / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Лукманова Л.И., Мурзабаев Х.Х., Викторова Т.В. (Патент РФ №2313275);
2.3. Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Викторова Т.В., Нартайлаков М.А., Комиссарова М.А., Лукманова Л.И. (Патент РФ №2324940);
2.4. Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце (Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2006144980).
-
Учебного пособия: «Лекции по биологии» / Т.В. Викторова, Г.И. Лукманова, Г.В. Белалова, Ф.Ф. Мусыргалина и др.: в 2-х кн. - Уфа: БГМУ, 2005. – Ч. 2. - 252 с.
-
Монографии: «Эхинококкоз печени» / М.А. Нартайлаков, В.В. Плечев, Д.Р. Мушарапов, Г.И. Лукманова. – Уфа, 2006. - 104 с.
-
Монографии: «Генетические факторы риска эхинококкоза» / Г.И. Лукманова. – Уфа, 2008. - 115 с.
Материалы исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах биологии; инфекционных болезней ИПО; детской хирургии, ортопедии и анестезиологии Башкирского государственного медицинского университета; в работу Самаркандского научного центра детской хирургии; клинической больницы №1, г. Стерлитамака.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Возбудитель эхинококкоза у детского населения Башкортостана принадлежит штамму G1 – «общий, домашних овец» E. granulosus и по структуре маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 гомологичен зарегистрированным в “GenBank” полиморфным вариантам Acc. No DQ109036, Acc. No U50464.
-
Полиморфизмы генов комплекса гистосовместимости HLA локусов DRB1, DQB1 и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1А1, GSTM1 являются структурными элементами генетической компоненты индивидуальной подверженности к эхинококкозу детей, инвазированных штаммом G1 E. granulosus.
-
В популяциях человека имеет место полиморфизм аллелей генов-кандидатов (HLA-DRB1, HLA-DQB1, CYP1А1, GSTM1), что вносит вклад в различия клинических проявлений гидатидозного эхинококкоза.
-
Данные о вкладе аллельных вариантов генов в развитие эхинококкоза у человека, могут быть использованы при прогнозировании характера течения заболевания и формировании групп повышенного риска.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Национальном конгрессе «Болезни органов дыхания» (С.-Петербург, 2003); IV Международной конференции «Современные проблемы общей, медицинской и ветеринарной паразитологии» (Витебск, 2004); VII Международной конференции «Циклы» (Ставрополь, 2005); IV Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция России в Евросоюз» (Уфа, 2005); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2005); Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения» (Уфа, 2006); II региональной научно-практической конференции Приволжского Федерального округа «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском Федеральном округе» (Казань, 2006); Всероссийской научной конференции «Теоретические и практические вопросы паразитологии» (Кемерово, 2006); Республиканской научно-практической юбилейной конференции (Уфа, 2006); V Республиканской научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития современной паразитологии» (Витебск, 2006); Х Международной научной конференции «Здоровье семьи ХХ1 век» (Бангкок, 2006); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2007); на заседаниях кафедры биологии БГМУ, 2002- 2008.
Публикации.
Результаты диссертационной работы опубликованы в 27 научных изданиях, в том числе 2 монографии и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 3 патента РФ на изобретение.
Объем и структура диссертационной работы.
Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 20 таблицами. Состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (176 отечественных и 173 зарубежных публикаций) и приложения.
Благодарности.
Автор выражает глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, д.м.н., профессору А.А. Гумерову, сотрудникам клиники кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии БГМУ за помощь в сборе материала. Автор выражает глубокую признательность заместителю директора по науке, д.м.н., профессору М.М. Туйгунову, сотрудникам лаборатории ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» МЗ СР РФ, за помощь оказанную при постановке молекулярно-генетических методов. Автор выражает благодарность заведующей лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН д.б.н., профессору Э.К. Хуснутдиновой, в.н.с. И.М. Хидиятовой за помощь в работе.
