Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема иммунологической реактивности организмов при опухолевом росте остаётся одной из важнейших научных проблем в современной биологии. Вопрос о том, почему на фоне достаточной иммунологической реактивности возникают и растут опухолевые клетки, резко отличающиеся по своим морфологическим и функциональным параметрам, способные не только подавлять, но и стимулировать иммунологические свойства организма, является не только центральным вопросом иммунобиологии и экспериментальной онкологии, но и биологии развития, молекулярной биологии и генетики (Аничков Н.М., 2004).
Иммунобиологические исследования взаимодействия организмов с опухолевыми клетками и тканями показывают, что определяющим фактором в предупреждении возникновения и развития, в эффективной элиминации опухолевых клеток является стимуляция как специфических, так и неспецифических защитных систем организма и иммунитета в целом. Такая стимуляция предполагает воздействие на все компоненты противоопухолевой системы, в том числе - блокирование поздних этапов развития опухоли для предупреждения распространения опухолевых клеток в организме и возникновения вторичного опухолевого роста (Якубовская Р.И., 2000). Несмотря на значительные успехи экспериментальной онкологии и молекулярной биологии, проблемы стимуляции иммунитета при опухолевом росте не решены. Опухолевый рост является системным иммунобиологическим процессом, поражающим весь организм, все звенья его иммуногенетической и нейроэндокринной регуляции, поэтому проблема стимуляции иммунитета и изучения взаимоотношений в системе «организм-опухоль» важна не только в плане предотвращения потенциального опухолевого роста, но и с точки зрения изучения динамики развития этих процессов, особенно на поздних этапах опухолевого процесса (Барышников А.Ю., 2003). Взаимоотношение опухоли с иммунной системой организма имеет два аспекта – специфический, ассоциированный преимущественно с цитотоксическими лимфоцитами, и неспецифический, определяемый как часть системного взаимодействия опухоли и организма. Системные иммунобиологические процессы при опухолевом росте достаточно сложны и трудно поддаются тривиальному анализу.
Большая вариабельность различных показателей состояния иммунной системы не позволяет достаточно четко определить состояние иммунологической недостаточности при опухолевом росте (Лебедев К.А., 1990, Абелев Г.И., 1999). Проблема описания и прогнозирования системных взаимоотношений между организмом и опухолью может быть решена на основе биоинформационного моделирования. В основу адекватной математической модели взаимодействия опухоль-иммунитет должны быть заложены экспериментальные параметры, для которых существуют хорошо отработанные, воспроизводимые методы определения состояния иммунологической реактивности. Не последнюю роль в обеспечении адекватной иммунологической реактивности в отношении опухолевого роста играет эндокринная система. Ряд гормонов является одним из важнейших звеньев регуляции иммунореактивности организма и может вызывать как иммуносупрессию и стимуляцию роста опухолевых тканей, так и его подавление. В современной экспериментальной онкологии отсутствуют эффективные информационные модели, отражающие максимально возможный спектр разнонаправленных взаимодействий иммунной и эндокринных систем в динамике опухолевого роста.
Традиционными направлениями экспериментальной онкологии и биологии противоопухолевых защитных систем организма является их стимуляция с помощью фармакологических агентов, естественных механизмов и продуктов жизнедеятельности иммунокомпетентных клеток (Sauter B. et al., 2000), интерферонов (Gao Y. et al., 2003), лимфокинов (Ridolfi R. et al., 2002), направленной лимфоцитарно-клеточной и генной терапии (Rodriguez-Lecompte J.C. et al., 2004). Иммуномодулирующие эффекты биофизических методов воздействия на опухолевые ткани практически не исследованы. В этом смысле наиболее перспективными представляются методы лазериндуцированной гипертермии, при которых возможно не только разрушение опухолевой ткани, но и стимуляция апоптоза (Toyota N. et al., 1998, Sapozhnikov A.M. et al., 1999, Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002), системных и локальных механизмов иммунного ответа (Chen W.R. et al., 2004). Существенно повысить их эффективность позволяет использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц, селективно накапливающихся в опухолевой ткани (Khlebtsov N.G. et al., 2004, Bernardi R.J. et al., 2008, Huff T.B. et al., 2007, Visaria R. et al., 2007). Селективное накопление наночастиц в опухоли обусловлено повышенной васкуляризацией и проницаемостью эндотелия кровеносных сосудов и капилляров опухоли. Фенестрация эндотелия, обилие трансэндотелиальных каналов, неполноценность или отсутствие базальной мембраны эндотелия, дисфункции лимфатической системы приводят к пассивному накоплению в опухолевой ткани наночастиц, введённых в системный кровоток. Биологические особенности воздействия золотых наночастиц на организм и иммунологическая реактивность при лазерной гипертермии биотканей с их использованием не изучены.
Цель исследования – установить закономерности иммуномодулирующих эффектов и тканевых реакций при управляемой локальной лазерной гипертермии опухолей с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц.
Задачи исследования:
- определить статистические закономерности возникновения, динамику развития и гистологические типы наиболее часто встречающихся спонтанных опухолей у экспериментальных животных;
- создать базу данных основных параметров иммунитета и уровня гормонов в динамике развития спонтанного опухолевого процесса, эффективных для построения нейросетевого классификатора;
- установить основные тканевые и иммуномодулирующие эффекты локальной лазерной гипертермии поверхностных тканей у животных с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц;
- установить тканевые и иммуномодулирующие эффекты золотых плазмонно-резонансных наночастиц при их системном введении и локальной лазерной гипертермии тканей спонтанных и перевитых опухолей животных;
- разработать биоинформационную модель биологической системы «иммунитет-опухоль» при экспериментальной системной и локальной иммуномодуляции.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментальный управляемый локальный лазерный термолиз опухолевых тканей у животных с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц оказывает системные иммуномодулирующие эффекты.
2. Использование золотых нанооболочек при локальной лазерной гипертермии биотканей позволяет увеличить скорость нагрева и сократить время выхода на стационарный управляемый температурный режим до 100 сек. Динамика температуры биотканей при локальной лазерной гипертермии in vivo с золотыми наночастицами имеет характерные особенности, обусловленные эффектами терморегуляции.
3. Биологические тканевые реакции при системном введении золотых наночастиц зависят от их размера: максимально накапливаются в тканях частицы диаметром 160 нм, а наиболее значительные морфологические изменения в органах наблюдаются для частиц диаметром 50 нм. Уменьшение концентрации золота в крови экспериментальных животных происходит нелинейно, зависимость концентрации от времени может быть аппроксимирована экспоненциальным законом.
4. Биоинформационная модель описания нелинейной динамики взаимодействия «иммунная система-опухоль» с учетом внешнего воздействия и нейросетевой подход к оценке состояния экспериментальных животных являются эффективными методами анализа иммунологической реактивности.
Настоящее диссертационное исследование выполнено при поддержке РФФИ (грант № 07-02-01434 «Теоретическое и экспериментальное исследование контрастирования новообразований в биотканях при низкокогерентной оптической томографии с помощью золотых наночастиц») и Министерства науки и инноваций РФ (госконтракт № 02.512.11.2034 «Разработка нанотехнологии лазерного селективного фототермолиза и контрастирования злокачественных новообразований на основе использования плазмонно-резонансных наночастиц»).
Научная новизна исследования состоит в том, что впервые на основе репрезентативного объёма рандомизированных наблюдений определены статистические закономерности по частоте возникновения и органному распределению спонтанных опухолей эпителиальной тканевой природы, их патоморфологическая характеристика и пролиферативные свойства в длительном эксперименте, установлена закономерная динамика параметров общего иммунитета, биохимических показателей и уровня гормонов в организме животных. На основе полученной базы данных выявлены наиболее эффективные параметры иммунологической реактивности в динамике развития спонтанного опухолевого процесса, реализовано обучение нейросетевого классификатора и построение нелинейной биоинформационной модели взаимодействия «иммунная система организма - опухоль», выявлены основные биологические закономерности взаимоотношения опухоли с иммунной системой организма, необходимые для построения адекватной математической модели. Автором проведен анализ требований к математической модели коррекции противоопухолевого иммунодефицита и впервые, на основе предложенной математической модели, получены фазовые портреты систем, описывающие динамику количества опухолевых клеток в организме животного, противоопухолевых антител и концентрации интерлейкина-2 при лазерной гипертермии. Впервые на примере опухолей эпителиальной природы с различной степенью антигенности и скоростью пролиферации реализованы различные сценарии динамики исследуемой системы «иммунитет - опухоль» при иммуномодуляции с использованием фармакологических агентов и лазерной гипертермии. Впервые установлены биологические закономерности распределения в организме экспериментальных животных золотых наночастиц в различных тканях и органах и определены биофизические аспекты их действия при лазерной гипертермии. Показано, что при системном введении золотых наночастиц в организм экспериментальных животных, пораженных опухолевым процессом, наблюдается статистически значимое более высокое пассивное накопление наночастиц в опухолевых тканях по сравнению с неизменёнными, а временная динамика повышения их концентрации в опухолевой ткани имеет два выраженных максимума. Впервые с использованием разработанной биоинформационной модели установлен иммуномодулирующий эффект золотых наночастиц при их введении в системный кровоток экспериментальных животных и усиление элиминирующего воздействия локальной лазерной гипертермии на опухоли эпителиальной тканевой природы.
Научно-практическая значимость. Полученные в работе результаты численного моделирования пространственного распределения температуры и экспериментальные термограммы модельных объектов и реальных биологических тканей in vivo при различной глубине локализации золотых плазмонно-резонансных наночастиц и различных режимах лазерного воздействия необходимы для разработки методов лазерного фототермолиза и определения его системных и локальных тканевых биологических эффектов. Результаты проведенных модельных экспериментов позволяют оценить, на какой максимальной глубине залегания области повышенной концентрации наночастиц можно добиться существенной величины поглощенной энергии, достаточной для повышения в этой области температуры на заданную величину, и указывают направление развития и совершенствования лазерных технологий и приборов, используемых в биологии и медицине. Исследования системных и локальных тканевых биологических реакций при лазерной гипертермии на экспериментальных животных, включая лазерную гипертермию с использованием золотых наночастиц, могут быть положены в основу создания новых методов малоинвазивного лечения поверхностных опухолевых заболеваний эпителиальной природы животных и человека. Разработанная автором методика проведения термографических исследований у животных с использованием компьютерного моделирования является эффективным инструментом в оценке различных физиологических и патологических процессов в биологических экспериментах. Разработанная автором биоинформационная модель нелинейного взаимодействия иммунной системы экспериментальных животных с опухолями эпителиальной природы является математической основой для построения адекватных моделей развития пролиферативных процессов и оценки иммуномодулирующих воздействий биологических, фармакологических, и биофизических агентов в экспериментальной иммунологии, онкологии и патологии животных.
Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве, состоит в обосновании и разработке концептуальной модели исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщении результатов и формулировании выводов. Автором лично проведены экспериментальные работы в рамках выполнения гранта РФФИ и Госконтракта Министерства науки и инноваций. Использованные в исследовании золотые наночастицы синтезированны в лаборатории биосенсоров и наноразмерных структур ИБФРМ РАН (рук-ль - д.ф.-м.н. проф. Н.Г. Хлебцов), электронно-микроскопические фотографии получены в лаборатории электронной микроскопии НИИ «Микроб» (рук-ль - к.б.н. Н.П. Коннов), измерения на атомно-абсорбционном микроскопе проводились в Центральной лаборатории ООО «Саратоворгсинтез» (рук-ль - д.х.н., проф. А.В. Шантроха), разработка математического обеспечения для компьютерного моделирования светорассеяния в биотканях и численного анализа дифференциальных уравнений выполнялась в ГОУ ВПО Саратовский государственный университет на кафедре оптики и биомедицинской физики (рук-ль - д.ф.-м.н. проф. В.В. Тучин) и кафедре нелинейной физики (рук-ль - член-корр РАН д.ф.-м.н. проф. Д.И. Трубецков), гистологические препараты изготовлены на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет Росздрава РФ (зав. кафедрой - д.м.н. проф. Г.Н. Маслякова).
Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации используются при проведении научных исследований в ИБФРМ РАН, НИИ естественных наук ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» Федерального агентства по образованию РФ, а также в учебном процессе этого учреждения на кафедре биохимии и биофизики биологического факультета, на кафедре оптики и биомедицинской физики физического факультета при чтении спецкурсов по дисциплинам «биофизика» и «лазерные методы в медицине» для студентов специальностей «биохимическая физика» и «медицинская физика». Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» Росздрава РФ при обучении студентов специальности «лечебное дело» и клинических ординаторов по дисциплине «патологическая анатомия». По материалам диссертационного исследования изданы пособия «Практические рекомендации по иммуноферментной диагностике онкологических заболеваний органов размножения у животных» (2005), «Применение метода клинической цитологии в ветеринарной практике» (2006), утвержденные секцией «Патологии, фармакологии и терапии животных» ОВМ РАСХН в качестве научно-практических рекомендаций.
В процессе выполнения диссертационного исследования разработаны оригинальные методики в области экспериментальной онкологии, защищенные действующими патентами РФ: на изобретение № 2298421 (2005) «Способ дренирования области удаленного подмышечного лимфоузла у собак при мастэктомии первой пары молочных желез с лимфанодэктомией», на изобретение № 2299738 (2005) «Способ лечения остеолизиса при метастазировании злокачественного образования в кости у собак», на изобретение № 2320293 (2006) «Способ коррекции иммунной недостаточности при лечении верифицированных форм рака молочной железы и меланомы собак», на изобретение № 2338472 (2007) «Способ овариогистерэктомии при раке левого яичника с экстирпацией метастаз из забрюшинного пространства у животных», на изобретение № 2329074 (2008) «Способ лазерной деструкции меланомы слизистой оболочки у собак», на изобретение №2342102 (2007) «Способ расширенной мастэктомии пятой молочной железы с первичной опухолью при наличии метастазов в поверхностный паховый лимфоузел у собак».
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены на II Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине” (Троицк, 2006), II Всероссийской конференции по вопросам онкологии и анестезиологии мелких домашних животных (Москва, 2006), VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина: современные проблемы и перспективы развития (Саратов, 2006), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных» (Воронеж, 2006), Full Meeting «Optical Technologies in Biophysics and Medicine» (Саратов, 2006, 2007, 2008), «27-th Annual Conference ASLMS» (Грапевайн, Техас, США, 2007), «International Congress of Toxicology ICT XI» (Монреаль, Канада, 2007), «Congress Optics and Photonics» (Сан Диего, США, 2007), XVI Московском международном ветеринарном Конгрессе (Москва, 2008), «Photonics West BiOS «Complex Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics V» (Сан Хосе, Калифорния, США, 2008), «BiOS 2008 - Plasmonics in Biology and Medicine V» (Сан Хосе, Калифорния, США, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы электронного машиностроения» (Саратов, 2008), V Съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), «Photonics life 4 European network of excellence for Biophotonic» (Брюссель, Бельгия, 2008), «PIBM 2008 - 7th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine» (Ухань, Китай, 2008), «Нанотехнологии в онкологии - 2008» (Москва, 2008).
Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 52 научных работах, из них 11 – в отечественных и иностранных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 6 - являются патентами РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 312 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающих 7 разделов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 77 отечественных и 308 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 103 рисунками.
