Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13-42
1.1. Классификация патологий печени 13-18
1.2. Строение и функции печени 18-23
1.3. Методы коррекции и восстановления гомеостаз печени 23-28
1.4. Взаимосвязь гепатобилиарной и желудочно-кишечной систем и их роль в процессе детоксикации организма 28-30
1.5. Микробиоценоз кишечника собак 30-32
1.6. Методы коррекции микробиоценоза кишечника 33-39
Заключение 39-42
2.1. Собственные исследования 42-63
2.1.1. Материалы и методы 42-44
2.1.2. Доклинические исследования 44-53
2.1.3. Клинические исследования 53-57
2.1.4. Разработка методов стандартизации препарата «Гепопро» 60-62
2.2. Результаты исследований 63-129
2.2.1. Доклинические исследования 63-93
2.2.1.1 .Изучение безвредности препарата «Гепопро» 63
2.2.1.2. Изучение острой токсичности препарата «Гепопро» 63-68
2.2.1.3. Изучение хронической токсичности препарата «Гепопро» 68-74
2.2.1.4. Результаты гистологических исследований препарата «Гепопро» 74-83
2.2.1.5. Оценка гепатопротективной эффективности препарат «Гепопро» на моделях острого и хронического токсического гепатитов 83-88
2.2.1.6. Оценка безопасности применения препарата «Гепопро» 88-93 -
2.2.2. Клинические исследования 94-129
2.2.2.1. Изучение клинического статуса животных больных токсическим гепатитом 94
2.2.2.2. Результаты изучения микробиоценоза кишечника собак больных токсическим гепатитом 94-98
2.2.2.3. Влияние препарата «Гепопро» на микробиоценоз кишечника собак с токсическим гепатитом 98-107
2.2.2.4. Оценка функции гепатобилиарной системы собак больных токсическим гепатитом, по биохимическим показателям крови до применения препарата «Гепопро» 107-110
2.2.2.5. Влияние препарата «Гепопро» на биохимические показатели крови собак с токсически гепатитом 110-113
2.2.2.6. Оценка функции гепатобилиарной системы собак с токсическим гепатитом по клиническому анализу крови 113-115
2.2.2.7. Влияние препарата «Гепопро» на восстановление морфологических показателей крови собак, больных токсическим гепатитом 115-121
2.2.3. Стандартизация показателей качества пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» 122-129
3. Обсуждение результатов 129-138
4. Выводы 139-140
5. Практические предложения 141
6. Список литературы
- Строение и функции печени
- Методы коррекции микробиоценоза кишечника
- Разработка методов стандартизации препарата «Гепопро»
- Результаты изучения микробиоценоза кишечника собак больных токсическим гепатитом
Введение к работе
Актуальность темы. За последние годы в ветеринарии приобрела особую актуальность проблема роста патологий гепатобилиарной системы, которые негативно влияют на физиологический статус организма животного.
Большая часть гепатобилиарных патологий этиологически и
патогенетически взаимосвязана с желудочно-кишечными патологиями, в
том числе с количественными и качественными изменениями микрофлоры
желудочно-кишечного тракта, которые способствуют формированию
неспецифического реактивного гепатита, внутрипеченочного холестаз,
печеночно-клеточной дисфункции, воспалительных процессов
внепеченочного билиарного тракта.
Современные экологические условия, увеличение интенсивности воздействия химико-физических и биологических факторов, а также чрезмерное назначение лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков и гормонов, несбалансированное кормление, создают предпосылки к росту таких патологий. Это касается, в первую очередь, аспектов воспроизводства и содержания собак.
Доказано, что печень и микрофлора кишечника участвуют в процессах печеночно - кишечной рециркуляции различных органических и неорганических соединений. Следовательно, печень и микрофлора пищеварительного тракта являются двумя взаимосвязанными детоксикационными системами микроорганизма [22, 72, 73, 112]. При этом повреждение печеночных клеток, снижение их функциональной активности неизбежно ведет к увеличению воздействия токсических веществ на кишечную микрофлору, что может быть причиной нарушений микробиоценоза кишечника, в свою очередь эти нарушения индуцируют детоксикационную функцию микрофлоры, тем самым, увеличивая токсическую нагрузку на печень [9, 21, 73, 75, 114].
Одним из перспективных направлений в комплексном решении проблемы печеночных и желудочно-кишечных патологий является создание новых комбинированных препаратов - пробиотиков-гепатопротекторов, использование которых способствует своевременной детоксикации организма, восстановлению гепатобилиарной и желудочно-кишечной систем.
Очевидно, что необходимость конструирования и применения пробиотика с гепатопротективным действием напрямую связана с частотой возникновения патологий гепатобилиарной и гастроинтестинальных систем различной этиологии.
Комбинированное применение гепатопротекторов с использованием пробиотических композиций является эффективным инструментом в компенсации патологии печени и нарушении микробиоценоза.
Пробиотики — лекарственные препараты, состоящие из микроорганизмов нормальной микрофлоры человека и животных и оказывающие полезное действие на животное-хозяина путем улучшения его кишечного микробного баланса [53,102,104].
Главной целью использования пробиотиков является защита целостности популяции кишечной микрофлоры посредством стимуляции роста полезных микроорганизмов или посредством внесения полезных бактерий путем прямого принудительного засева [89,98].
В современных условиях пробиотики служат важным и необходимым инструментом защиты организма, в первую очередь, от дисбактериозов, возникающих как следствие нерациональной антибиотикотерапии, перенесенных кишечных заболеваний, длительного применения противовоспалительных препаратов, цитотоксической терапии, неправильного питания и стрессов [36, 37,100].
Назначение пробиотиков при патологиях печени позволяет уменьшить степень эндогенной интоксикации, уменьшая образование токсических эндогенных соединений, в том числе и солей желчных кислот [23, 61].
Следует отметить, что ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной терапии для лечения заболеваний печени, составляет более одной тысячи лекарственных средств.
Однако среди них выделяют небольшую группу препаратов, действие
которых направлено на восстановление гомеостаза печени, нормализацию
активности органа и стимуляцию регенеративных процессов —
гепатопротекторы, которые составляют 9,2% от общего количества лекарственных средств [11].
По механизму действия они подразделяются на следующие группы:
антиоксиданты - растительные полифенолы (силибор, силимар, карсил, катерген, сибектан, гепатофальк планта, легалон, фламин, конвафлавин), витамины (ос-токоферол, ретинол, пантотеновая кислота, витогепат), тиолы (цистеин, N-ацетилцистеин, малотилат);
средства, осуществляющие репарацию мембран гепатоцитов - препараты фосфолипидов (эссенциале, липостабил);
стимуляторы регенерации паренхимы печени (метионин, уридин, цитидин, оротовая кислота).
Вследствие наибольшей доступности, самыми применяемыми препаратами в ветеринарии являются лекарственные средства, в основу которых входят естественные или полусинтетические флавоноиды расторопши пятнистой (Silybum marianum).
Основным компонентом экстракта плодов расторопши пятнистой является силимар (силибинин), представляющий собой смесь трех основных изомерных соединений - силибинина, силикристина и силидианина. Все изомеры имеют фенилхроманоновую структуру (флавогликаны) [62,64]. Полагают, что в механизме гепатопротективного действия препаратов расторопши главным является свойство стабилизировать клеточные и субклеточные мембраны. Антиоксидантный эффект препаратов расторопши пятнистой обусловлен взаимодействием компонентов лекарственного средства со свободными радикалами в печени и
7 преобразованием их в менее токсичные соединения, что приводит к сохранению высокой активности ферментов пентозофосфатного шунта, цикла трикарбоновых кислот Р-окисления жирных кислот в гепатоцитах, что обеспечивает достаточно высокий уровень энергетических и пластических процессов в печени; снижает солюбилизацию ферментов и уменьшает гиперферментемию. При этом ускоряется регенерация клеток печени за счет активации РНК-полимеразы, торможение проникновения токсинов в клетки печени, что вызывает физико-химическую стабилизацию клеточной мембраны гепатоцитов, тем самым, предотвращая выход из клетки ферментов и других веществ. Препараты расторопши обладают радиопротекторными свойствами, усиливает детоксицирующую и внешнесекреторную функцию печени, оказывая спазмолитическое и небольшое противовоспалительное действие [11,47,95].
Гепатозащитные средства предназначены для нормализации функции»и метаболизма печени при ее поражениях, ускорения регенерации, восстановления функциональной активности гепатоцитов и используются в терапии острых, хронических гепатитов токсической, лекарственной этиологии, циррозов печени и жирового гепатоза.
Использующиеся в настоящее время гепатопротекторы не могут одновременно восстанавливать функции печени и оказывать действие на измененную микрофлору кишечника, которая участвует в процессе метаболизма желчных кислот и детоксикации. Отдельное назначение пробиотиков, в свою очередь, не дает возможности полностью купировать воспалительные процессы в печени.
Таким образом, патогенетический подход к, комплексному лечению гепатопатий предполагает восстановление микрофлоры кишечника' и печени посредством использования пробиотиков» и гепатопротекторов, многокомпонентный препарат, сочетающий в себе пробиотик и гепатопротектор, позволит действовать на несколько патогенетических механизмов одновременно.
При создании нового препарата, основной целью является создание условий благоприятных для восстановления как гепатобилиарной, так и желудочно-кишечной систем, поэтому в рецептуру лекарственного средства должны быть включены компоненты с доказанной гепатопротективной активностью и влияющие на восстановление кишечного микробиоценоза, а также вспомогательные вещества, разрешенные для применения в области ветеринарии.
Все компоненты, входящие в состав препарата «Гепопро», (коммерческое название «Биопротектин»), по отдельности хорошо изучены в доклинических и клинических исследованиях. Каждый из используемых компонентов зарегистрирован как фармакопейная субстанция.
В состав препарата входят основные вещества силимар (силибинин), пробиотическая композиция, состоящая из бифидо и лактобактерий, а также вспомогательные вещества, такие как лактулоза и высокодисперстный кремнезем.
Силимар (сиилибинин), используемый в-препарате представляет собой очищенный сухой экстракт из плодов расторопши пятнистой (Silibum marianum), содержащий комплекс флаволигнанов. Фармакологические свойства силибинина выражаются в подавлении нарастания индикаторных ферментов, торможении процесса цитолиза, предотвращении развития холестаза, нормализации функционально-морфологических показателей гепатобилиарной-системы и клинических показателей. [48].
Bifidobacterium bifidum штамм №1 и Lactobacillus fermentum № 90Т-С4, депонированные в институте им*. Л. А. Тарасевича, включенные в состав препарата «Гепопро» (коммерческое название- «Биопротектин») в сорбированной форме, изучены в клинической дозировке суммарно
1x10 КОЕ. При этом детоксицирующие свойства микроорганизмов существенно усилены за счет сорбента - высокодисперстного кремнезема.
Высокодисперстный кремнезем (диоксид кремния) — субстанция, которая входит в состав многих лекарственных средств в таблетированной, порошковой, мазевой и суппозиторной формах. Вместе с тем диоксид кремния имеет не менее значимое самостоятельное клиническое применение, прежде всего благодаря своей мощной адсорбирующей способности и отсутствию токсичности для животных [46,86].
В препарате «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин») диоксид кремния (БіОг) использован в качестве сорбента бифидо- и лактобактерий для создания колонизационных агрегатов на стадии приготовления препарата.
Лактулоза - лекарственная субстанция, применена в составе «Гепопро» (коммерческое название «Биопротектин») в качестве бифидогенного фактора, необходимого для роста и вегетации бифидобактерий.
В мировой литературе имеются сведения о позитивном влиянии всех включаемых в состав препарата компонентов на восстановление* физиологического статуса организма животных, однако полностью отсутствуют данные, показывающие эффективность применения комбинации пробиотиков и гепатопротекторов в одном препарате для лечения патологий гепатобилиарной системы животных и влияние на микробиоценоз животных, в частности, собак.
В настоящее время в нашей* стране на рынке ветеринарных препаратов нет отечественных комбинированных препаратов, в состав которых входит композиция пробиотических штаммов и гепатопротективного компонента.
Исходя- из этого, необходимость изучения вопросов совместного влияния компонентов комбинированных препаратов гепатобилиарную и желудочно-кишечную системы и эффективности препарата является очевидной, так как они не только дополнят имеющиеся' сведения о механизме действия* пробиотиков и гепатопротекторов, но и будут способствовать обоснованному применению комбинированного лекарственного средства: пробиотика-гепатопротектора в ветеринарии.
10 Цель работы
Целью настоящих исследований явилась разработка нового комплексного пробиотика-гепатопротектора, для лечения патологий гепатобилиарной системы, восстановления микробиоценоза кишечника собак в комплексной терапии гепатитов.
Основные задачи исследований
в опытах на лабораторных животных изучить безвредность, острую и хроническую токсичность препарата «Гепопро»;
оценить влияние препарата «Гепопро» на функциональное состояние печени лабораторных животных;
установить гепатопротективную эффективность препарата на экспериментальной модели острого и хронического гепатита на лабораторных животных;
провести оценку безопасности применения препарата «Гепопро»;
изучить влияние препарата «Гепопро» на динамику восстановления кишечного микробиоценоза собак при комплексной терапии токсических гепатитов;
оценить влияние препарата «Гепопро» на восстановление биохимических и клинико-морфологических показателей крови у собак при комплексной терапии токсических гепатитов препаратом «Гепопро»;
разработать методы стандартизации пробиотика-гепатопротектора «Гепопро».
Научная новизна
Впервые разработан комбинированных препарат пробиотик-гепатопротектор для лечения токсических поражений печени к собак.
Установлено, что разработанный пробиотик-гепатопротектор, эффективен в комплексной терапии гепатитов собак токсической этиологии.
Показано позитивное влияние пробиотика-гепатопротектора на восстановление морфо-функциональной структуры печени и кишечного микробиоценозва.
Подтверждена безвредность и отсутствие острой и хронической токсичности препарата «Гепопро» в доклинических и клинических испытаниях.
Практическая значимость работы
Разработана и утверждена нормативная документация на пробиотик-гепатопротектор «Гепопро»: технические условия 9337-008-16414608-08 (согласованы с Россельхознадзором); инструкция по применению пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» в ветеринарии (Утверждена Россельхозназором).
На базе ЗАО «Партнер» (г. Москва) организовано производство
препарата.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
параметры токсичности пробиотика-гепатопротектора «Гепопро»
для животных;
влияние пробиотика-гепатопротектора «Гепопро» на динамику
восстановления морфо-функциональной структуры печени и кишечного
микробиоценоза;
биохимические и клинико-морфологические показатели крови собак
при лечении токсических гепатитов различной этиологии пробиотиком-
гепатопротектором.
дозы и схема применения пробиотика-гепатопротектора «Гепопро»
методы контроля качества пробиотика-гепатопаротектора «Гепопро»
Связь исследований с научной программой
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГУ «ВГНКИ».
12 Апробация результатов
Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактерийных болезнях животных Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»); 9-ом Славяно-Балтийском форуме «Санкт-Петербург-Гастро 2007» Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); 6-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), 7-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008).
Публикации По теме диссертации опубликовано 4 работы из них 1 - в издание, рецензируемом ВАК РФ.
Строение и функции печени
Печень (hepar - лат.) является важным многофункциональным органом, с участием которого происходит большинство метаболических процессов в организме [22, 81].
Это паренхиматозный орган, самая крупная пищеварительная железа сложнотрубчатого строения [20,33,83].
Печень у взрослых животных лежит позади диафрагмы, её диафрагмальная поверхность выпуклая, а висцеральная поверхность вогнутая. Она удерживается на диафрагме венечной связкой, также соединена связками с правой почкой, желудком и двенадцатиперстной кишкой.
По своей форме печень у разных видов животных не одинакова. У собак печень очень большая, с глубокими вырезками. Поверхность печени покрыта брюшиной. Под ней лежит печеночная капсула, состоящая из плотной соединительной ткани, которая проникает внутрь органа и разделяет паренхиму на дольки.
Гепатоцит - структурная" клеточная единица, печени, имеет неправильную гексагональную форму, с нечетковыраженными сглаженными углами, в центральной части которой, расположено ядро.
Митохондрииг равномерно распределены в цитоплазме гепатоцита [45]. В них содержится около 95 % всех ферментов клетки и сосредоточены важнейшие ферментные системы: ферменты цикла Кребса, переносчики электронов дыхательной цепи, дезаминирования, трансаминирования, окисления жирных кислот, ДНК - и РНК - полимеразы. Митохондрии -очень динамичная структура, быстро реагирующие на действие различных повреждающих факторов [134,135]. Лизосомы, органеллы обычно локализованы у билиарного полюса гепатоцита. Они содержат 36 ферментов, в основном, гидрогеназы. Ферменты лизосом находятся в неактивном состоянии, их активация происходит при повышении проницаемости или при разрыве лизосомальной мембраны. Аппарат Гольджи (внутриклеточный аппарат) состоит из двойных мембран, образующих большие вакуоли с гладкими стенками, маленькие пузырьки и плоские цистерны [46,81].
Физиологическая роль печени многогранна. Печень является основным органом обмена веществ. Она секретирует желчь, является депо крови и некоторых витаминов, её купферовские клетки участвуют в фагоцитозе, в ней образуются белки, входящие в состав свертывающей и противосвертывающей систем крови. В эмбриональном периоде печень считается кроветворным органом [21,76,83] .
Метаболические процессы в печени характеризуются высокой энергоёмкостью, источником энергии при этом являются как анаэробный цикл Кребса, так и макроэрги-нуклеотиды, дающие энергию за счет высвобождения фосфатидных связей при переходе аденозинтрифосфата (АТФ) в аденозиндифосфат (АДФ)[32,45,133].
Белково-синтетическая функция печени имеет большое значение для организма, поскольку синтезируемые в печени белки плазмы крови выполняют транспортную функцию, доставляя во все органы и системы вещества, необходимые для обеспечения нормального обмена веществ, пластическую функцию, снабжая материалом белково-синтезирующие системы печени и других органов. Следует отметить, что белки плазмы играют роль в сохранении относительного постоянства внутренней среды организма, поддерживая определенное осмотическое давление и рН крови, а также равновесие электролитов[87,105,107]
В печени совершается большая часть процессов, связанных с обменом углеводов. Углеводы, поступающие в кишечник, переходят под действием ферментов в моносахариды. Кишечной стенкой они всасываются после предварительного фосфорилирования. Печень удерживает значительную часть поступающего из кишечника сахара и переводит его в особую форму коллоидального полисахарида-гликогена, который откладывается в клетках печени и служит резервом углеводов в организме [99,138].
Кроме того, в печени происходят следующие виды метаболизма: метаболизм галактозы, синтез и распад гликогена, процессы глюконеогенеза, окисление глюкозы. Главными конечными продуктами расщепления углеводов являются летучие жирные кислоты, в процессе окисления которых выделяется энергия [131].
Обмен липидов состоит из двух процессов: эмульгирования и гидролиза молекул триглицеридов под действием липаз. После элиминации из русла крови липиды быстро подвергаются метаболизму, включаясь в анаболические или катаболические процессы. Печень занимает ведущее место в образовании ацетоновых тел [113,135]. Ацетоновые тела присутствуют в организме животного в небольшом количестве, что является нормальным промежуточным продуктом углеводно-липидного обмена. Вместе с тем, в клетках печени насыщенные жирные кислоты превращаются в ненасыщенные, происходит образование фосфолипидов и синтез холестерина [69,100].
Известно, что печень участвует в образовании и метаболизме билирубина. Гепатоциты захватывают пигмент из крови, конъюгируют билирубин и выделяют водорастворимые конъюгаты билирубина в.желчные капилляры. Конечным этапом метаболизма билирубина в клетках печени является его экскреция в желчь[68,93].
Методы коррекции микробиоценоза кишечника
В настоящее время для коррекции кишечного биоценоза используют пробиотики, пребиотики исинбиотики.
Пробиотики - лекарственные препараты, состоящие из микроорганизмов нормальной микрофлоры человека и животных и оказывающее полезное действие на животное-хозяина путем улучшения его кишечного микробного баланса [102,106].
Главной целью использования пробиотиков является защита целостности популяции кишечной микрофлоры посредством стимуляции роста полезных микроорганизмов или посредством внесения полезных бактерий путем прямого принудительного засева [90,99,110]. Эти препараты делят на две группы: прямого и непрямого действия. Первые представляют собой живые одиночные или симбионтные микроорганизмы, а вторые -продукты их метаболизма, богатые факторами роста (аминокислоты, ферменты), обладающие антагонистической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.
По классификации Шендерова Б.А. [90,91], препараты для коррекции микробиоценоза можно разделить на 6 групп: 1 - препараты, содержащие монокультуры живых микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры; 2 - препараты, содержащие комплекс живых микроорганизмов; 3 - препараты, содержащие субстанции, которые при- оральном введении стимулируют рост и размножение индигенной микрофлоры, и, прежде всего, бифидо- и лактофлоры; 4 - препараты, содержащие монокультуры или комплекс микроорганизмов и субстанций, стимулирующих их приживление, рост и размножение; 5 - препараты, содержащие генно-инженерные штаммы микроорганизмов с заданными характеристиками; 6 - препараты, содержащие помимо микроорганизмов- или средств, стимулирующих их рост и размножение, другие соединения, влияющие на функции клеток органов и тканей .
К числу бактерий-пробионтов относят гомо- и гетероферментативные лактобациллы, молочно-кислые стрептококки, бифидобактерии и спорообразующие аэробные бактерии [103,117].
Препараты, используемые на основе бактерий-пробионтов, широко используются во всех странах для профилактики и лечения дисбактериозов, коррекции микробного пейзажа кишечника при антибиотикотерапии и терапии химиопрепаратами, а также в комплексной терапии гепатопатий [18,61,118].
Бактерии - пробионты, помимо антагонистических функций по отношению к энтеропатогенным бактериям, осуществляют синтез веществ, необходимых для жизнедеятельности организма, участвуют в общем метаболизме, синтезе белков и аминокислот и способствуют пищеварению, а так же участию в процессах инактивации токсических веществ.
Пробиотики используют в профилактике и лечении смешанных желудочно-кишечных инфекций, расстройств пищеварения алиментарной этиологии, возникающих вследствие резкого изменения состава рациона, нарушения режима кормления, стрессов, переустановления микрофлоры пищеварительного тракта после лечения антибиотиками другими антибактериальными и химиотерапевтическими препаратами, а также улучшения процессов пищеварения, ускорения адаптации животных к высокоэнергетическим кормам [6,119].
Штаммы, используемые для приготовления пробиотиков, должны отвечать основным требованиям: быть нормальными обитателями желудочно-кишечного тракта, являться непатогенными и нетоксигенными, переносить пассаж через желудок и быть метаболически активными в экосистеме кишечника, обладать способностью к адгезии на эпителии и приживлению в пищеварительном тракте, быть стабильными и способными длительное время оставаться жизнеспособными при хранении в производственных условиях [27].
Разработка методов стандартизации препарата «Гепопро»
Содержимое капсулы № 0 должно давать положительную реакцию на силимар. Капсулу № 0 с препаратом вскрывают, высыпают силимар в чашку Петри и переносят 0,05 г в пробирку с 10 мл этилового спирта 96%. Силимар растворяют в спирте, прибавляют 0,25 г пыли цинковой и 1 см3 кислоты хлористоводородной концентрированной. Появление малинового окрашивания свидетельствует, что в растворе присутствует силимар.
Для определения количества силибинина (силимара) в одной капсуле, взвешивают 5 капсул с препаратом. Все капсулы вскрывают, извлекают капсулы № 3, тщательно очищают от силимара и взвешивают. Количество силимара определяют по формуле: С = (А-а-В) : 5 , где С - вес силибинина (силимара) в одной капсуле А - вес капсулы № 0 с препаратом; а — вес капсулы № 0 без препарата (используют данные из сертификата качества на капсулы); В - вес капсулы № 3 с препаратом; Взвешивание проводят в двух повторностях. Вес должен быть не менее 0,1г.
Сущность метода заключается в определении бактерийной чистоты препарата путем посева исходного разведения на дифференциально-диагостические среды для выявления грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.
Исходную суспензию препарата, рассеивают на чашки Петри с плотной агаризованной средой; -для выявления энтерококков суспензию высевают на поверхность предварительно подсушенной агаризованной среды. Обработку результатов проводят через 24-48 часов культивирования при (37±1) С. Учёт результатов производится по стандартной методике; -контаминацию препарата осмотолерантными дрожжами и плесневыми грибами определяют, используя агаризованную среду. Обработка результатов производится по стандартной методике. - контаминацию препарата бактериями семейства Enterobacteriaceae определяют на стандартных средах.
После термостатирования посевов просматривают выросшие колонии. При наличии колоний, характерных для энтерококков, бактерий семейства Enterobacteriaceae, протея, синегнойной палочки, дрожжей и плесеней, колонии изолируют и проводят микроскопию мазков, окрашенных по Граму.
Препарат не должен быть контаминирован бактериями семейства Enterobacteriaceae, Enterococcus, Staphilococcus (aureus), осмотолерантыми дрожжами и плесневыми грибами. Допустимый уровень сапрофитной микрофлоры - не более 50,0 тыс./КОЕ.
Экспериментальные данные обрабатывались методом статистического анализа, с использованием пакета компьютерных статистических программ Statgraf, Systaf, Statgraf plus.
Кроме того, проводили анализ результатов по Плохинскому Н. А., а так же средние и интервальные оценки параметров экспериментальных выборок на основе t-статистики (критерии Стьюдента) в соответствии с требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ[5,85].
Все экспериментальные данные по изучению фармакодинамики препарата «Гепопро» выполнены лично автором. Работа по оценке острой и хронической токсичности препарата «Гепопро» выполнены совместно с д.б.н. И. Г. Осиповой, с.н.с. Н. В. Терешкиной ( ГИСК им. Л. А. Тарасевича), н.с. И. В. Высочиным (Научный центр по безопасности биологически активных веществ). Всех соавторов настоящих исследований автор искренне благодарит.
Автор выражает глубокую признательность зам. генерального директора ЗАО «Партнер» по научно-медицинской деятельности Т. В. Мацулевич и зам. начальника департамента науки ЗАО «Партнер» к.б.н., с.н.с. В.Д. Болотову , а также директору и главному врачу ветеринарной клиники «На Талалихина» Т. Б. Горовой и М. В. Матвеевой, на базе которой проведено испытание препарата «Гепопро», за оказанную ими помощь, научные дискуссии и предоставленную возможность для проведения проверки лечебно-профилактических свойств препарата «Гепопро» (коммерческое название Биопротектин).
Результаты изучения микробиоценоза кишечника собак больных токсическим гепатитом
Как отмечено в табл. 20, при клиническом анализе крови собак с токсическим гепатитом во всех случаях было зафиксировано значение гематокрита в опытной группе 44,20 ±0,3 %; 43,50±0,05%; 44,80±0,3% и 45,10±0,1%; 42,50±0,5%; 44,25±0,25% в контрольной группе. Показатели гемоглобина составили 9,60±0,02 г/дл; 11,50±0,05 г/дл; 10,20±0,4 г/дл в опытной группе и 12,00±0,002 г/дл; 11,90±0,03 г/дл; 12,20±0,7 г/дл в контрольной группе, что ниже нормативного показателя.
Кроме того, было зафиксировано повышение СОЭ до показателей: 9,00±0,6 мм/ч; 8,26±0,9 мм/ч; 13,10±0,9 мм/ч у собак в опытной группе и 11,70±0,8 мм/ч; 9,50±0,2 мм/ч; 10,30±0,2 мм/ч у собак в контрольной группе, при этом значение показателей лейкоцитов находились в пределах физиологической нормы.
Показатели лейкоцитарной формулы выявили отклонение от физиологической нормы; так, например, палочкоядерные нейтрофилы составляли 6,50±0,03%; 3,50±0,005%; 4,00±0,02% в опытной группе и 5,15±0,02%; 5,70±0,2%; 4,25±0,2% в контрольной группе, что превышает физиологическую норму, тогда как сегментоядерные составляли 36,2±0,03%; 36,10±0,02%; 32,80±0,2% в опытной группе и 31,70±0,3%; 38,20±0,7%; 35,00±0,03% в контрольной группе находясь в пределах нормы, так же как эозинофилы и моноциты. Следует отметить, что показатели базофилов и юных при этом незначительно завышали верхние границы нормы.
С целью сравнительной характеристики гепатопротективной терапии при лечении токсических гепатитов собак были использованы как опытный препарат «Гепопро», так и зарегистрироованный препарат «Легалон».
Влияние препарата «Гепопро» на восстановление морфологических показателей крови собак, больных токсическим гепатитом.
Изучение влияния гепатопротективного препарата «Fenonpo» на клинические показатели крови собак проводилось с 3 по 23 день заданного-терапевтического курса лечения в треж опытных группах животных с количеством животных по 10 собак- в каждой; Для сравнения также проводилось изучение клинических показателей крови с препаратом1 «Легалон».
Полученные данные из табл. 27 свидетельствуют о том, что на третие сутки было выявлено ухудшение показателей: крови как в опытных, так и в контрольных группах. По всей вероятности, это связано с высокой степенью интоксикации организма животных, характеризующееся снижением гематокрита до показателей 40,00±0,12%; 43#0±0,05%; 4Т,90±0,3% в: опытных подгруппах и до показателей 40,00±0,02%; 39;80±0,01%; 41,20±0,7% в контрольных подгруппах. Показатели, гемоглобина: так же имели тенденцию к снижению в обеих группах.
Кроме того, отмечено повышение показателей: Є03 как в опытных, так и в контрольных подгруппах до: 25 60±0j01 мм/ч;: 12,60±0,04 мм/ч; 25,00±0,02 мм/чи 11,90±0,3 мм/ч; 11,00±0;05 мм/ч; 18,00±0,2 мм/ч.
Следует отметить, что большинство показателей; лейкоцитарной; формулы -также имели: отклонения от ранее зафиксированного результата: в\ сторону увеличения.
Через 7 суток применения Препарата; как показывает табл. 28- в . контрольной: группе: отмечено: повышение гематокрита: и; гемоглобина а также зафиксировано:снижение:показателя СОЭ-в.трех подгруппах до 19;00± 2,0 мм/ч; 9,3 0±0,01: мм/ч; 20,10±0 02 мм/ч, что было наиболее характерно выражено1 в сравнении с подгруппами собак, получавших препарат «Легалон», где СОЭ:снизилось менее значительно.
Показатели лейкоцитарной формулы составили: - по палочкоядерным нейтрофилам - 6,90±0,2%; 5,50±0,03%; 3,00±0,1% в опытных подгруппах и 8,80±0,01%; 8,5±0,02%; 7,90±0,08% в контрольной подгруппах. Кроме того, все остальные группы нейтрофилов также имели тенденцию к увеличению.
Как следует из табл. 29, на 14 сутки применения препарата в одной из опытных групп (2 подгруппа) показатель гематокрита достиг физиологической нормы и составил 44,0±0,01%. Показатель гемоглобина так же практически достиг физиологической нормы как в опытной, так и в контрольной группах.
Такие же изменения были отмечены с показателем СОЭ , который составил в опытной группе с препаратом «Гепопро» 7,40±0,02 мм/ч; 5,10±0,01 мм/ч; 7,90±0,1 мм/ч и в контрольной группе с препаратом «Легалон» - 7,30±0,03 мм/ч; 7,80±0,04 мм/ч; 13,90±0,01 мм/ч.
Показания лейкоцитов оставалось в пределах нормы в обеих группах, тогда как показатели лейкоцитарной формулы приблизились к значениям, зафиксированным до проведения курса лечения, но по-прежнему не входили в границы показателей физиологической нормы:
Через 23 дня применения препарата (табл.28) наблюдалась положительная динамика восстановления клинических показателей крови животных.
У собак опытной группы показатель гематокрита во всех трех подгруппах находился в пределах физиологической нормы и составил 45,80±0,02%; 46,10±0,03%; 43,90±0,1%, тогда как в-контрольной группе во 2 подгруппе все-таки показатель гематокрита оставался заниженным и составил 42,50±0,5% на фоне двух других подгрупп с показателями 44,00±0,1% и 44,00±0,01%.
