Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Мутагенное действие ионизирующего излучения 11
-
Нестабильность генома ' 13
-
Сравнительная радиочувствительность различных стадий
гаметогенеза 14
1.2. Минисателлитные последовательности ДНК 18
-
Общая характеристика тандемно повторяющихся последовательностей 18
-
Морфологическая характеристика минисателлитных последовательностей ДНК 19
-
Функциональная характеристика минисателлитных
последовательностей ДНК ' 20
1.2.4.Мутации в минисателлитных локусах ДНК 21
1.3. Применение минисателлитных локусов ДНК 24
1.3.1. Использование мутаций в минисателлитных локусах ДНК как
маркера химического мутагенеза 25
1.3.2. Использование мутаций в минисателлитных локусах ДНК как
маркера радиационного воздействия 27
Экспериментальные работы на животных 27
Исследования, проведенные на человеке 31
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
2.1. Характеристика обследованного контингента 45
2.1.1. Радиоэкологическая характеристика территории
Южного Урала 45
2.1.2. Характеристика обследованных групп 48
2.2. Методы исследования 69
2.2.1 Выделение ДНК *. 70
-
Генотипирование образцов 71
-
Определение размера и происхождения мутации 71
-
Использованные статистические методы 73
ГЛАВА III. ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО РАДИАЦИОННОГО
ОБЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТУ ВОЗНИКНОВЕНИЯ МУТАЦИЙ В
МИНИСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСАХ ДНК ЧЕЛОВЕКА 75
-
Зависимость частоты мутаций от факта облучения родителей 75
-
Анализ частоты возникновения мутаций
в минисателлитных локусах мужских половых клеток 82
3.2.1. Дозовая зависимость частоты мутирования
мужских половых клеток 82
-
Зависимость частоты минисателлитных мутаций от мощности дозы облучения гонад отцов 84
-
Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту мутаций в минисателлитных локусах мужских половых клеток 86
3.3. Анализ частоты возникновения мутаций в минисателлитных локусах
женских половых клеток 92
-
Дозовая зависимость частоты мутирования женских половых клеток 92
-
Зависимость частоты минисателлитных мутаций от мощности дозы облучения гонад матерей 94
-
Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту мутаций в минисателлитных локусах женских половых клеток 94
-
Влияние внутриутробного и постнатального облучения на частоту мутаций в минисателлитных локусах ДНК потомков облученных родителей 98
-
Комплексная оценка влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на частоту мутаций в минисателлитных локусах ДНК человека 103
4 3.6. Возможная связь мутаций, возникших в миписателлитных локусах ДНК половых клеток родителей и состояния здоровья
их потомков 105
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 114
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126
ПРИЛОЖЕНИЕ! 138
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ
ESTR - Expanded shot tandem repeats
HPRT - hypoxanthine phosphorybosyl transferase
RAPD - PCR - random amplified polymorphic DNA - polymerase chain reaction
TCR - T cell receptor
TRDS - Techa river dose system
VNTR - variable number of tandem repeats
ВУРС - Восточно-уральский радиоактивный след
ГРП - геолого-разведочная партия
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ККМ - красный костный мозг
ЛПЭ - линейная потеря энергии
МКБ - медицинская классификация болезней
НСГ - нестабильность генома
РИНСГ - радиационно-индуцированная нестабильность генома
Р-РНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота
СИЧ - счетчик излучения человека
УНПЦ РМ - Уральский научно-практический центр радиационной медицины
УФО - ультрафиолетовое облучение
ЧАЭС - Чернобыльская атомная электростанция
Введение к работе
В настоящее время установлено, что изменения в генах человека или структуре его хромосом могут приводить к изменениям фенотипа организма. Степень этих изменений зависит от роли данных генов в реализации тех или иных функций организма, от масштабов нарушений, произошедших в генах и от характера наследования возникших изменений [26].
Известно, что мутации могут возникать при действии на организм самых различных внешних и внутренних факторов: физических, химических или биологических [28,40,54]. В настоящее время, в связи с активным развитием атомной промышленности, широким использованием источников ионизирующего излучения в промышленности, науке, медицине и других сферах человеческой деятельности, особое внимание привлекает к себе проблема влияния ионизирующего излучения на возникновение мутационных изменений в генотипе. С другой стороны, пристальное внимание уделяется вопросу влияния радиации не только на здоровье людей, непосредственно подвергшихся облучению, но и на здоровье их потомков, которые непосредственно не облучались. Это в первую очередь связано с тем фактом, что мутации, возникшие в половых клетках организма, способны передаваться следующему поколению [2,26,28].
Основные закономерности формирования генетических изменений при действии ионизирующего излучения установлены в экспериментах на животных. Значительно реже источником информации о генетических эффектах являлись наблюдения за людьми, подвергшимися радиационному воздействию при аварийных ситуациях [1,28,103]. Как правило, изучение влияния радиации на мутагенез происходило с использованием систем, изменения в которых легко можно было отследить фенотипически - на морфологических признаках организма, а так же при помощи оценки частоты возникновения новообразований, или изменения характера биохимических процессов, протекающих в организме [1,28]. Методологическим недостатком
7 перечисленных подходов являлось то, что признаки, которые изучались с помощью данных методов, закодированы в генотипе с помощью малокопийных или вообще уникальных генов. Частота возникновения мутаций в них ничтожно мала, в связи с чем, выборки при проведении исследований должны включать в себя большие группы экспериментальных животных или изучаемых людей [2,71,122]. Значительно сложней оценить влияние на геном малых доз радиации. В этом случае для проведения эксперимента потребовались бы еще более крупные выборки. Задача исследования частоты мутаций в человеческих популяциях при этом практически невыполнима [26,103].
Ситуация несколько изменилась с открытием некодирующих тандемно повторяющихся локусов ДНК [75,76,97]. Данный класс повторов характеризуется широким распространением в геноме и высокой частотой мутирования, которая в несколько раз превышает таковую для кодирующих повторов ДНК [30,38,42,72,74,76]. Поэтому для проведения исследований с использованием в качестве маркера воздействия радиации тандемных повторов ДНК требуется гораздо меньшая выборка, чем для исследований с использованием традиционных методов оценки частоты мутаций.
Наиболее важными представителями данного класса повторов являются микросателлитные и минисателлитные повторы ДНК. В настоящее время активно исследуется возможность их использования для целей биоиндикации и биодозиметрии [42,51,55,60,61].
Цель исследования: оценить влияние хронического радиационного воздействия на частоту возникновения мутаций в минисателлитных локусах ДНК у лиц, проживавших в прибрежных селах реки Теча.
Задачи исследования: 1. Оценить влияние хронического комбинированного облучения в диапазоне низких и промежуточных доз (0,2 - 624 мГр) на частоту возникновения мутаций в минисателлитных локусах ДНК людей, подвергшихся радиационному воздействию в результате проживания в прибрежных селах реки Теча.
Изучить зависимость частоты мутаций в минисателлитных локусах ДНК от индивидуальных преконцептивных гонадных доз облучения отца и матери на год зачатия ребенка.
Оценить зависимость частоты мутаций в минисателлитных локусах ДНК от мощности дозы облучения гонад отца и матери в год зачатия ребенка.
Оценить влияние внутриутробного облучения в диапазоне доз на красный костный мозг 0,1 - 91 мГр на частоту мутаций в минисателлитных локусах ДНК.
Оценить влияние основных нерадиационных факторов (возраст родителей, курение, употребление алкоголя) на частоту мутаций в минисателлитных локусах ДНК.
Научная новизна исследования:
Проведенное исследование впервые позволило оценить влияние индивидуальных гонадных доз родителей, облученных в диапазоне низких и промежуточных доз на частоту возникновения мутаций в минисателлитных локусах ДНК их половых клеток. Установлено, что при облучении гонад отцов в диапазоне доз 0,3 - 624 мГр наблюдается достоверное (р<0,05) увеличение частоты мутаций в мужских половых клетках. Показано, что при облучении материнских гонад в диапазоне доз 0,2 - 493 мГр не происходит увеличения частоты мутаций в женских половых клетках.
Впервые проанализировано влияние мощности дозы облучения гонад родителей на частоту возникновения минисателлитных мутаций в их половых клетках. При этом не установлено влияния мощностей доз в диапазоне 0,1-157 мГр/год на частоту возникновения мутаций.
Впервые оценено влияние доз внутриутробного облучения на частоту обнаружения мутаций в минисателлитных локусах ДНК потомков облученных родителей. Показано, что внутриутробное облучение в диапазоне доз 0,1 - 91 мГр не оказывает влияния на частоту возникновения минисателлитных мутаций.
Впервые оценена роль ряда нерадиационных факторов (возраст родителей, курение, употребление алкоголя, профессиональные вредности) в возникновении мутаций в минисателлитных локусах ДНК. Установлено, что ни один из исследованных факторов не оказывает достоверного влияния на частоту возникновения мутаций.
Впервые оценена возможность использования метода учета минисателлитных мутаций для целей биологической индикации и биологической дозиметрии в отдаленные сроки хронического радиационного воздействия в диапазоне малых и средних доз облучения. Показано, что данный метод непригоден для ретроспективной биологической индикации и биологической дозиметрии в условиях комбинированного хронического облучения в диапазоне преконцептивных гонадных доз 0,3 - 624 мГр.
Положения, выносимые на защиту;
У мужчин, подвергшихся хроническому радиационному облучению вследствие проживания в прибрежных селах реки Теча в диапазоне индивидуальных преконцептивных гонадных доз 0,3 - 624 мГр возрастает частота мутаций в минисателлитных локусах ДНК половых клеток. У женщин, подвергшихся хроническому воздействию ионизирующего излучения в диапазоне индивидуальных преконцептивных гонадных доз 0,2 - 493 мГр увеличения частоты мутаций в минисателлитных локусах ДНК не отмечается.
Не установлено зависимости частоты мутаций в минисателлитных локусах мужских и женских половых клеток от индивидуальной преконцептивной гонадной дозы облучения родителей, внутриутробного облучения потомков (диапазон доз на красный костный мозг 0,1 - 92 мГр и на мягкие ткани 0,2 - 91 мГр) и мощности дозы облучения гонад родителей в год зачатия ребенка. Такие нерадиационные факторы как возраст родителей на момент зачатия ребенка, курение, употребление
10 алкоголя не оказывают значимого влияния на частоту обнаружения мутаций в минисателлитных локусах ДНК. Практическая значимость:
Анализ показал, что облучение гонад отцов в отличие от облучения гонад матерей, приводит к увеличению частоты мутаций в мужских половых клетках, что должно учитываться при оценке дифференцированного генетического риска облучения мужчин и женщин. Частота минисателлитных мутаций может быть использована для ретроспективной биоиндикации хронического радиационного воздействия в диапазоне низких и промежуточных доз с низкой мощностью дозы облучения. Отсутствие четкой дозовой зависимости частоты мутаций в минисателлитных локусах от индивидуальной гонадной дозы облучения родителей и от мощности дозы облучения гонад родителей не позволяет использовать мутации минисателлитных локусов ДНК в целях ретроспективной биологической дозиметрии при данных условиях радиационного воздействия (хроническое комбинированное облучение в диапазоне низких и промежуточных доз).
Апробация работы:
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2006 г.), Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: Медико-биологические эффекты» (Челябинск, 2005 г.), на съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006 г.).
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
