Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Раздельное и совместное действие факторов физической и химической
природы на растения 13
1.1. Проблема оценки биологических эффектов малых доз ионизирующего
излучения 13
1.1.1. Анализ экспериментально наблюдаемых реакций клеток на облучение
в низких дозах 13
Феноменологическая схема формирования ответной реакции клетки на облучение в низких дозах 19
Механизмы формирования ответной реакции клетки на облучение 25
1.2. Механизмы поступления в растения ионов металлов и их детоксикация.. 30
Механизмы поступления ионов металлов в растения 31
Транспорт и распределение ионов металлов и тяжелых естественных радионуклидов по органам и тканям растений 35
Механизмы детоксикации ионов металлов при поступлении в растения 40
1.3. Токсический и мутагенный эффекты при действии ионов металлов на
растения 89
Роль физических и химических свойств ионов металлов в определении уровня их биологической эффективности 49
Зависимость уровня цитогенетических повреждений у растений от концентрации и времени воздействия металлов 53
Молекулярные и клеточные механизмы реакции растений на воздействие ионов металлов 58
1.4. Механизмы формирования ответной реакции клетки на совместное дей
ствие факторов разной природы 64
Механизмы совместного действия у-излучения с факторами нерадиационной природы 65
Цитогенетические эффекты у растений, индуцируемые при совместном действии ионов металлов и радионуклидов 72
1.5. Генетические эффекты и физиологические изменения у растений из при
родных биогеоценозов, характеризующихся повышенным содержанием тя
желых естественных радионуклидов 79
Глава 2. Материал и методы 93
Методика изучения раздельного и совместного действия 232Th с внешним у-излучением или Cd на традесканцию (клон 02) 93
Методика оценки токсичности 232Th и Cd по изменению оптической плотности суспензии Chlorella vulgaris Beijer 98
Методика изучения мутагенного и токсического действия 232Th и Cd
на Allium сера L 101
2.4. Методика оценки влияния факторов радиационной и химической
природы на уровень индуцируемых генетических эффектов у растений 104
Характеристика районов исследований и мест отбора проб 104
Методика биологического тестирования проб воды 106
Методика оценки генетической изменчивости горошка мышиного из природных ценопопуляций 107
2.5. Определение концентраций металлов и тяжелых естественных радио
нуклидов в пробах воды или растениях 107
2.6. Статистический анализ данных 108
Глава 3. Закономерности и механизмы действия внешнего у-излучения, Th и Cd
на растения 109
3.1. Зависимость мутагенного и токсического эффектов у традесканции (клон
02) от дозы у-излучения 111
Закономерности действия низких доз у-излучения на традесканцию (клон 02) в условиях почвенной культуры 111
Закономерности действия низких доз у-излучения на традесканцию (клон 02) в условиях водной культуры без элементов питания 118
3.2. Зависимость уровня токсического эффекта у Chlorella vulgaris Beijer
от концентрации 232Th или Cd 122
Закономерности и механизмы действия Cd на Chlorella vulgaris Beijer 123
Закономерности и механизмы действия 232Th на Chlorella vulgaris Beijer 133 Глава 4. Реакция клеток, тканей и органов растений на воздействие низких концентраций 232Th и Cd 144
Токсическое действие Cd на Allium сера L 144
Токсическое действие Cd на Tradescantia (клон 02) 151
Мутагенное действие низких концентраций Cd на Allium сера L. и Tradescantia (клон 02) 153
Токсическое действие Th на Allium сера L 157
Токсическое действие 232Th на Tradescantia (клон 02) 161
Мутагенное действие 232Th на Allium сера L. и Tradescantia (клон 02) 162
Глава 5. Закономерности реакции растений на совместное действие 232Тп с Cd и
внешним у-излучением 167
5.1. Закономерности совместного действия низких доз хронического у-
излучения и 232Th на Tradescantia (клон 02) 167
Совместное действие Th HCd на Allium сера L 172
Совместное действие Th и Cd на Tradescantia (клон 02) 186
Глава 6. Оценка влияния содержащихся в природных водах ионов металлов и тяже
лых естественных радионуклидов на уровень цитогенетических повреждений у рас
тений 194
Оценка влияния ионов металлов на уровень токсического и мутагенного эффектов у Tradescantia (клон 02) при поступлении из сложных по ионному составу природных вод 194
Оценка мутагенности и токсичности проб природных вод с территории радионуклидной аномалии 199
Глава 7. Оценка влияния радиоэкологических факторов на уровень генетической изменчивости в ценопопуляции горошка мышиного на участке с повышенным
уровнем естественной радиоактивности 209
Заключение 222
Выводы 234
Список литературы 237
Приложения 272
Введение к работе
Актуальность проблемы. Жизнь на Земле возникла и развивалась в условиях постоянного воздействия природных источников радиации. В настоящее время в результате интенсивного развития ядерной энергетики, горнодобывающей и перерабатывающей отраслей промышленности значительно возросло и не уступает (Gesell, Prichard, 1975; Алексахин и др., 1990) по мощности природным процессам влияние техногенной деятельности на увеличение содержания естественных радионуклидов в биосфере. Парадоксально, но именно недостаток данных о биологических эффектах, наблюдаемых в населяющих районы с повышенным естественным радиационным фоном (ПЕРФ) популяциях растений и животных, является наиболее существенным пробелом в наших знаниях (Real et al., 2004).
Большинство современных радиоэкологических исследований связано с изучением перераспределения в компонентах экосистем и биологического действия имеющих техногенное происхождение радионуклидов (137Cs, 90Sr и др.), хотя история их влияния на биосферу ограничена несколькими десятками лет. Это связано с впечатляющими последствиями катастроф на объектах ядерной энергетики, испытания и военного применения ядерного оружия.
В районах с повышенным естественным радиационным фоном существуют свои специфические радиоэкологические проблемы, связанные как с особенностями перераспределения тяжелых естественных радионуклидов (ТЕРН) в природных средах, так и их биологического действия. ТЕРН являются а-, р-, у-излучателями с высокой общей биологической эффективностью (ОБЭ) и одновременно химически токсичными элементами. Очевидно, нет оснований связывать все наблюдающиеся у животных и растений из районов с ПЕРФ изменения исключительно с радиационным воздействием. Накопление ТЕРН в организме, как правило, сопровождается аккумуляцией химических элементов - спутников этих радионуклидов, многие из которых оказывают токсическое и мутагенное действие. Климатические факторы также способны модифицировать индуцированные повышенным фоном естественной радиоактивности эффекты (Taulavuori et al., 2005; Алексахин и др., 1990).
Широкий спектр биологических эффектов (от стимуляции развития до угнетения и гибели), обнаруженных при изучении населяющих области с ПЕРФ природных популяций растений и животных, и существенное влияние других экологических факторов на уровень наблюдаемых в этих сообществах изменений постепенно привели к осознанию того, что интерпретация имеющихся данных невозможна без решения проблем корректной оценки биологических эффектов малых доз ионизирующих излучений и их модификации факторами нерадиационной природы.
Действительно, существуют экспериментальные подтверждения (Petin, Berdnikova, 1979; Петин, Комаров, 1989; Лысцов, 1993; Гераськин и др., 1996; Петин и др., 1999; Евсеева, Гераськин, 2001; Geras'kin et al., 2005) того, что синергические и антагонистические ответные реакции биологических систем не являются артефактами при сочетанном действии внешнего у-излучения и факторов химической природы, в частности, металлов. Однако данных о совместном действии тяжелых естественных радионуклидов с разными по физическим и химическим свойствам металлами и внешним облучением в научной литературе крайне мало для принятия обоснованных решений относительно того, в каких радиоэкологических ситуациях и на каком основании следует проводить мероприятия по ограничению радиационного воздействия на биоту. В связи с этим особенно важным становится изучение закономерностей и механизмов усиления либо ослабления биологического эффекта при одновременном действии факторов. Только такой подход позволит избежать множества логических и методологических ошибок, возникающих при анализе изменений, наблюдаемых в природных популяциях растений и животных, обитающих в условиях повышенного фона естественной радиоактивности.
В случае раздельного действия факторов, выяснение механизмов реакции биологических объектов также является крайне сложной задачей. В настоящее время не существует единого мнения даже по поводу формы зависимости «доза - эффект». В значительной мере это связано с недостатком информации о закономерностях действия низких, характерных для окружающей среды, доз ионизирующих излучений и концентраций металлов (Гераськин, 1995; Sanita' di Toppi, Gabbrielli, 1999). Еще более проблематичной становится корректная оценка состояния населяющих территории с повышенным фоном естественной радиоактивности природных популяций растений и животных вследствие практически полного отсутствия достоверных сведений об эффектах тяжелых естественных радионуклидов. Несмотря на то, что зарождение радиобиологии как науки связано именно с исследованием биологического действия тяжелых естественных радионуклидов (Корогодин, 1991), до настоящего времени существует ряд принципиально важных нерешенных вопросов в этой об-' ласти, касающихся механизмов действия ТЕРН на клеточные структуры, оценки радиобиологического и токсического эффектов этих элементов. Решению кратко изложенных здесь проблем биологического действия повышенного фона естественной радиоактивности посвящено настоящее исследование.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выявлении закономерностей реакции растений на раздельное и совместное действие внешнего облучения, тяжелых естественных радионуклидов и металлов.
7 Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Определить форму зависимости «доза - эффект» при действии на растения у-излучения, 232Th и Cd.
Оценить вклад процессов восстановления повреждений ДНК и эндогенного глута-тиона в снижение токсического эффекта низких и высоких концентраций 232Th и Cd.
Выявить закономерности реакции растений на раздельное и совместное кратковременное и длительное воздействие низких концентраций 232ТЪ с у-излучением или Cd.
Количественно охарактеризовать вклад в индукцию токсического и мутагенного эффектов у растений тяжелых естественных радионуклидов и металлов при поступлении из сложных по ионному составу природных растворов.
Оценить влияние внешнего облучения и инкорпорированных тяжелых естественных радионуклидов на генетическую изменчивость растений горошка мышиного (Vicia cracca L.) из природной ценопопуляции, длительное время заселяющей территорию с повышенным фоном естественной радиоактивности.
Научная новизна. Впервые с использованием различающихся систематическим положением растений - Allium сера, Tradescantia и Chlorella vulgaris - показано, что синерги-ческий и антагонистический типы реакции биологических систем на совместное воздействие факторов радиационной и химической природы являются закономерными событиями и возникают с наибольшей вероятностью при низких дозовых нагрузках, характерных для условий окружающей среды. По этой причине реально наблюдаемый уровень биологических эффектов в природных популяциях, населяющих радиоактивно загрязненные территории, часто существенно отличается от прогнозируемого на основе результатов экспериментальных исследований раздельного действия факторов. В этих условиях как внешнее облучение в низких дозах, так и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень генетической изменчивости в популяциях и возможности их адаптации к конкретной радиоэкологической ситуации.
Синергические мутагенные и токсические эффекты у растений могут возникать при совместном действии факторов в таких дозах, которые не являются остро токсичными, но индуцируют дополнительные к образующимся спонтанно потенциальные повреждения ДНК. В диапазоне низких доз действующих факторов могут быть обнаружены и антагонистические эффекты, выражающиеся в снижении частоты генных мутаций и аберраций хромосом без замедления митотической активности клеток и ростовых процессов растений. Для этого доза хотя бы одного из факторов должна быть достаточной для активации процессов восстановления повреждений ДНК. Увеличение интенсивности воздействия ведет к
8 проявлению достоверных токсических эффектов, регистрируемых, в зависимости от силы совместного влияния факторов, на уровне тканей, органов или организма в целом.
В диссертационной работе впервые показано, что форма зависимости мутагенного и токсического эффектов у растений от силы воздействия факторов радиационной и химической природы универсальна и характеризуется наличием трех участков, различающихся уровнем индуцируемых повреждений. В первом диапазоне регистрируемый биологический эффект не отличается достоверно от спонтанного, в пределах второго - статистически значимо превышает его, оставаясь на неизменном уровне. Сохранение неизменного (не отличающегося от контроля или достоверно повышенного) уровня цитогенетических нарушений в этих диапазонах дозовых нагрузок во многом связано с эффективностью восстановления повреждений ДНК. Дальнейшее увеличение интенсивности воздействия приводит к монотонному приращению отклика биологической системы. С использованием в качестве тест-объекта Chlorella vulgaris впервые показано, что эндогенный глутатион имеет большее значение для предотвращения развития индуцируемых 232Th свободнорадикальных процессов, чем при детоксикации Cd в качестве субстрата для образования фитохелатинов. Роль дополнительного синтеза эндогенного глутатиона, в отличие от процессов восстановления повреждений ДНК, проявляется в снижении эффекта высоких, являющихся токсичными, кон-центраций Cd или Th.
Впервые изучены закономерности реакции растений на раздельное кратковременное и длительное воздействие Cd и 232ТЪ в низких концентрациях, встречающихся соответственно в условиях слабо и средне загрязненных кадмием территорий или на участках с повышенным фоном естественной радиоактивности. Установлено, что при поступлении из водных растворов с одинаковой концентрацией Th вызывает однотипные реакции у различающихся систематическим положением растений - Allium сера, Tradescantia (клон 02) и Chlorella vulgaris. Воздействие 0.4 мкмоль/л 232Th не приводит к статистически значимому повышению уровня мутагенного и токсического эффектов. При содержании в растворе 1.6 мкмоль/л 232Th индуцирует достоверный токсический эффект. В концентрации 0.8 мкмоль/л 232Th стимулирует рост корней Allium сера. Выявленный эффект не связан с феноменом гормезиса, поскольку обусловлен достоверным увеличением по сравнению с контролем длины клеток в базальной части зоны растяжения корня и не является следствием возрастания скорости деления или пула пролиферирующих клеток. Мутагенный эффект 232Th проявляется при хроническом воздействии на клетки волосков тычинок Tradescantia (клон 02) и увеличивается пропорционально концентрации радионуклида в растворе. Реакция растений (Tradescantia (клон 02), Allium сера) на кратковременное и длительное
воздействие Cd при поступлении из водных растворов с разной концентрацией существенно различается. Низкие концентрации кадмия (0.009 мкмоль/л и 0.09 мкмоль/л) не являются остро токсичными и не индуцируют достоверных мутагенных эффектов, но при хроническом воздействии могут вызывать токсический эффект, ослабевающий с течением времени. В более высоких (5 мкмоль/л) концентрациях Cd приводит к достоверным мутагенному и токсическому эффектам уже при кратковременном (30 ч) воздействии. С течением времени токсический эффект усиливается.
Впервые количественно оценен вклад факторов радиационной и химической природы низкой интенсивности в индуцируемые генетические эффекты у растений из лабораторных и природных популяций. Показано, что при совместном действии радионуклиды и металлы даже в низких концентрациях статистически значимо влияют на уровень мутагенного и токсического эффектов у растений. В изученной радиоэкологической ситуации внешнее облучение выступает в качестве фактора отбора, увеличивая частоту эмбриональных летальных мутаций у растений, а инкорпорированный в надземной массе горошка мышиного
230тч *-* и
Гп определяет не только уровень внутрипопуляционнои цитогенетическои изменчивости, но и, увеличивая вариабельность растений по чувствительности к внешним воздействиям, -возможности адаптации этого вида. Ведущим фактором, обусловливающим высокий уровень двойных фрагментов, являющихся признаком радиационного воздействия, является инкорпорированный Ra.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные общие закономерности реакции растений на воздействие различающихся физическими и химическими свойствами факторов существенно упрощают решение задач экологического нормирования и позволяют с единых позиций оценивать опасность для биоты радиационных и химических воздействий.
Установленные инвариантность формы зависимости «доза - эффект» относительно действующих факторов и свойств биологических объектов, закономерности возникновения синергических и антагонистических эффектов существенно упрощают прогнозирование последствий влияния факторов радиационной и химической природы на фитоценозы.
Разработанная и апробированная в разных экологических ситуациях методология оценки вклада радиационной и химической составляющих в индуцируемые биологические эффекты у растений позволяет выявить факторы, интенсивность воздействия которых следует контролировать в первую очередь. Полученные результаты показывают, что при оценке опасности для экосистем радионуклидного и химического загрязнений необходимо применять комплексный, основанный на принципах экотоксикологии, подход. Причем на пер-
10 вом этапе целесообразно использовать методы биологического тестирования, позволяющие получить интегральную оценку действия присутствующих в природных средах компонентов. Если результаты биотестов оказываются положительными, следует прибегнуть к более детальным исследованиям, включая физико-химический анализ, выявление геохимических барьеров, определение параметров миграции загрязняющих веществ в конкретном ландшафте.
Положения, выносимые на защиту:
Синергический и антагонистический типы реакции биологических систем на совместное воздействие факторов радиационной и химической природы являются закономерными событиями и возникают с наибольшей вероятностью в диапазоне низких, характерных для условий окружающей среды, дозовых нагрузок.
Форма зависимости мутагенного и токсического эффектов у растений от силы воздействия факторов радиационной и химической природы универсальна и характеризуется наличием трех участков, различающихся уровнем индуцируемых повреждений.
При совместном действии тяжелые естественные радионуклиды и/или металлы даже в низких концентрациях вносят достоверный вклад в формирование мутагенного и токсического эффектов у растений.
Низкие дозы внешнего облучения и инкорпорированные тяжелые естественные радионуклиды оказывают достоверное влияние на уровень генетической изменчивости в природных популяциях растений.
Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Автором лично поставлена цель исследования и запланированы необходимые для ее осуществления эксперименты, проведен сбор образцов растений из природных популяций, проанализировано более 3/4 всех цитологических препаратов, выполнены статистическая обработка результатов собственных исследований и теоретический анализ данных литературы, сформулированы основные положения работы и выводы.
Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были доложены и представлены на IV Международном симпозиуме «Урал атомный. Урал промышленный» (Екатеринбург, 1996), Интернациональном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды в Арктике» (Тромсо, 1997), III Съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 1997), Научно-аналитической конференции «Человек на севере: условия и качество жизни» (Сыктывкар, 1998), Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000), Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасно-
сти жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2000), V Международной конференции по исследованию действия повышенного фона естественной радиации и радоноопасных территорий (Мюнхен, 2000), Международной конференции «Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции (Дубна, 2000), Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2001), XI Международном симпозиуме по биоиндикаторам (Сыктывкар, 2001), IV съезде по радиационным исследованиям (Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001), Международной конференции «Экология северных территорий России. Проблемы, прогноз ситуации, пути развития, решения» (Архангельск, 2002), Всероссийской научной школе «Актуальные проблемы экологического мониторинга: Научный и образовательный аспекты» (Киров, 2003), III Съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология и радиоэкология» (Киев, 2003), Международной конференции «Радиационная безопасность территорий. Радиоэкология города» (Москва, 2003), Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2004), Международной конференции «ЭКОРАД» (Экс-ан-Прованс, 2004), VI Международной конференции «Экология человека и природа» (Плес, 2004), I Североамериканской конференции «Воздействие низких доз радиации» (Онтарио, 2005), VI Международном симпозиуме по радиологической защите (Кардифф, 2005), II Международной конференции «Радиоактивность окружающей среды» (Остерас, 2005), Международной конференции «Радиоактивность после ядерных взрывов и аварий» (Москва, 2005), Международной конференции БИОРАД-2006 (Сыктывкар, 2006), V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), 3 Международной конференции «Металлы в окружающей среде» (Вильнюс, 2006).
По теме диссертации опубликовано 32 статьи, из них 18 - в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах и 1 монография.
Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, 4 приложений, списка литературы, включающего 452 источника, из них 225 - на иностранном языке. Диссертация изложена на 296 страницах и содержит 47 таблиц, 40 рисунков.
Благодарности. Выражаю искреннюю признательность научному консультанту д.б.н., профессору С.А. Гераськину за постоянную поддержку, помощь и ценные советы при подготовке диссертационной работы, научным сотрудникам отдела радиоэкологии к.б.н. Е.С. Белых и к.х.н. Т.А. Майстренко за помощь при проведении лабораторных и полевых экспериментов, дискуссии и участие в обсуждении результатов исследований, директору Института биологии Коми НЦ УрО РАН А.И. Таскаеву за пристальное внимание и по-
12 мощь в организации научных исследований, к.б.н. О.Н. Поповой за консультации по методическим вопросам при работе с природными популяциями горошка мышиного и помощь в сборе экспериментального материала, сотрудникам экоаналитической лаборатории Института биологии за проведение химических анализов образцов природных вод.
