Введение к работе
Актуальность проблемы. Стресс оказывает отрицательное влияние на организм сельскохозяйственных животных, приводит к снижению их продуктивности (уменьшению привесов, надоев, ухудшению качества мяса, меха и пр.) и изменению резистентности к различным заболеваниям. Это диктует необходимость широких исследований влияния стресса на различные системы организма сельскохозяйственных животных и, в особенности, их пищеварительную систему.
Органы пищеварения у человека и животных, являются важнейшим первичным звеном ассимиляции пищевых веществ, которое в значительной степени определяет общий метаболизм организма и его гомеостаз.
В последние десятилетия изучение действия стресса на пищеварительную систему у млекопитающих явилось предметом многочисленных исследований. Известно, что под влиянием стресса образуются язвы в желудке и двенадцатиперстной кишке (Selye, 1972, 1977; Glavin, 1980; Filaretova, 2007), нарушается кишечная моторика (Bueno et al.,1989; МcKay et al., 1994, 2006; Kiliaan et al., 1998; Saunders et al, 2002; Овсянников, Березина, 2007; Березина, Овсянников, 2009) и снижается кровоток (Меерсон, 1986; Mitchell et al., 1995; Ladewig, 2000; Wielebnowski, 2003). Обнаружено также под влиянием стресса изменение всасывания жидкости, электролитов (Barclay, Turnberg, 1987, Empey, Fedorak, 1989; Saunders et al., 1994; Ladewig, 2000) и повышение пассивной проницаемости тонкой кишки, в том числе по отношению к макромолекулам (Kiliaan et al.,1998; Sderholm, Perdue, 2001).
Несмотря на прогресс в изучении действия стресса на желудочно-кишечный тракт у млекопитающих, ряд аспектов этой проблемы, касающихся, в частности, его влияния на мембранное пищеварение и всасывание, остаются слабо изученными. Так, весьма неоднозначны данные научной литературы о реакции на стресс пищеварительных и транспортных систем тонкой кишки в отношении основных пищевых веществ, в частности углеводов. Практически не изучалась роль трофологического состояния организма (сытость и краткосрочное голодание) в отношении реакции указанных систем на стресс. Большим пробелом в современной физиологии и ветеринарии является отсутствие данных о реакции на стресс мембранных пищеварительных ферментов тонкой кишки у сельскохозяйственных животных. Наконец, до сих пор не оценивалась эффективность современных фармакологических препаратов в отношении коррекции отрицательных последствий стресса на примере стресс-реакции пищеварительных ферментов у сельскохозяйственных животных.
В настоящей работе было исследовано влияния стресса на мембранное пищеварение и всасывание у сельскохозяйственных животных, а также эффекта фармакологического препарата «Стоп-стресс» в отношении коррекции этого влияния на мембранное пищеварение, впервые проводилось на кроликах. В предварительных опытах использовались также крысы в качестве удобной и хорошо изученной физиологической экспериментальной модели.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в том, чтобы на сельскохозяйственных животных (кролики) и экспериментальных моделях (крысы) исследовать реакцию на стресс со стороны мембранных ферментов, участвующих в расщеплении углеводов и эфиров фосфорной кислоты, и системы мембранного транспорта глюкозы в тонкой кишке в зависимости от времени после воздействия стресс-фактора и трофологического состояния организма, а также оценить эффективность применения фармакологического препарата «Стоп-стресс» на примере реакции на стресс ферментов, участвующих в мембранном пищеварении.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. В предварительных опытах на экспериментальной модели (крысы) изучить влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на активность дисахаридазы (мальтаза) и щелочной фосфатазы в слизистой оболочке тонкой кишки в различные сроки после воздействия стресс-фактора и в зависимости от трофологического состояния организма (сытость и голодание в течение 18-20 ч);
2. Исследовать, на той же экспериментальной модели влияние стресса (антиортостатический наклон -60) на всасывание глюкозы в тонкой кишке в условиях хронического опыта в различные сроки после воздействия стресс-фактора и в зависимости от трофологического состояния организма (сытость или голодание в течение 18-20 ч);
3. В опытах на кроликах исследовать влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на активность ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в слизистой оболочке тонкой кишки у животных, предварительно голодавших в течение 24 ч.
4. Оценить эффект предварительного введения кроликам фармакологического препарата «Стоп-стресс» на изменение активности ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в слизистой оболочке тонкой кишки после стресса (иммобилизация животных в течение 3 ч) на фоне голодания.
5. Определить содержание кортикостерона в крови животных в разные сроки после воздействия стресс-факторов.
Научная новизна работы. В результате модельных исследований впервые изучено влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на мембранные гидролитические ферменты, участвующие в расщеплении углеводов (мальтаза) и эфиров фосфорной кислоты (щелочная фосфатаза), а также на систему мембранного транспорта глюкозы в слизистой оболочке тонкой кишки в динамике и при различном трофологическом состоянии организма. Впервые установлены изменения активности мальтазы и щелочной фосфатазы в различных отделах тонкой кишки кроликов под влиянием стресса (иммобилизация в течение 3 ч) и выявлены общие и специфические особенности реакции указанных ферментов на стресс у этих животных по сравнению с крысами. Разработаны дозы, кратность и способы применения фармакологического препарата «Стоп-стресс» для кроликов.
Получены новые сведения эффективности применения препарата «Стоп-стресс» при коррекции стресс-реакции мембранных пищеварительных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) у кроликов.
Основные положения, выносимые на защиту
У кроликов кратковременный стресс, вызванный иммобилизацией в течение 3 ч на фоне голодания, приводит через сутки после воздействия к снижению активности пищеварительных мембранных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в тонкой кишке.
Применение препарата «Стоп-стресс» ослабляет отрицательное действие стресса в отношении поведения животных и реакции на стресс со стороны пищеварительных мембранных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза).
Научно-практическая ценность работы. Проведённые нами исследования расширяют теоретические представления о влиянии стресса на пищеварительные и всасывательные системы тонкой кишки животных и о возможности коррекции стресс-реакции с помощью современных фармакологических препаратов. Полученные данные могут быть полезны для применения препарата «Стоп-стресс» в животноводческих хозяйствах, в частности, в кролиководстве, для снижения отрицательного воздействия технологических стресс-факторов и риска возникновения постстрессорных состояний. Данный препарат не вызывает морфологических изменений тонкой кишки.
Материалы диссертации могут быть использованы в научно-исследовательской работе, при чтении лекций и на практических занятиях таких кафедр, как внутренние болезни животных, клинической диагностики, фармакологии и токсикологии, физиологии и патологической физиологии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию академика А.М. Уголева (1926-1991) (Санкт-Петербург, 2006); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007); Шестой Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008); Пятой Международной научной конференции «Донозология – 2009. Проблемы здорового образа жизни» (Санкт-Петербург, 2009); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2010).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 1 статья в журнале из списка рекомендованных ВАК Минобразования и науки России.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, общего заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 8 таблиц, 21 рисунок и 9 таблиц в Приложении.
Список литература включает 288 источника, в том числе 138 на иностранных языках.
2. Материал и методы исследования
Исследования проводились на кафедре внутренних болезней животных им. А.В. Синёва ФГОУ ВПО « СПБ ГАВМ» и в лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Все эксперименты выполнялись в полном соответствии с требованиями по гуманному обращению с животными.
Предварительные эксперименты по оценке влияния стресса на мембранное пищеварение были выполнены на крысах, как наиболее хорошо изученном физиологическом объекте. Использовано 104 лабораторных животных – белых крыс-самцов линии Вистар с массой 150-260 г, содержавшихся на стандартном пищевом рационе.
В качестве умеренного стресса использовали иммобилизацию животного в течение 3 ч в клетке, ограничивающей подвижность животного. Для выявления роли трофологического состояния в реакции на стресс опыты проводили на сытых животных или голодавших в течение 18-20 ч.
Хронические опыты проводились на 14 крысах-самцах в полном соответствии с требованиями по гуманному обращению с животными. Техника хирургической операции и условия проведения экспериментов были аналогичны тем, которые использовались в оригинальной методике А.М. Уголева и Б.З. Зарипова (Уголев, Зарипов, 1979; Уголев и др., 1981, 1986).
Участок тощей кишки длиной 20 см изолировался на расстоянии 15 см дистальнее двенадцатиперстной кишки. В оба конца изолированного отрезка кишки вставлялись металлические фистулы, которые выводились наружу. Изолированную петлю тонкой кишки перфузировали раствором глюкозы 50 мМ. Концентрацию глюкозы в пробах оттекающего перфузата определяли глюкозооксидазным методом (Dahlqvist, 1964).
В качестве экспериментальной модели умеренного стресса в хронических опытах использовался антиортостатический наклон животного под углом -60 в течение 1 ч.
Основные исследования проводились на сельскохозяйственных животных – 20 кроликах-самцах породы Белый и Серый великан в возрасте 5-6 месяцев с массой тела 3,0-3,3кг.
Животные были разделены на четыре группы по 5 животных в каждой: 1– интактные животные (контроль); 2– животные, подвергавшиеся кратковременному стрессу; 3– животные, получавшие в течение 5 дней антистрессовый препарат; 4 – животные, которые получали в течение 5 дней антистрессовый препарат и затем подвергались кратковременному стрессу.
В качестве модели кратковременного стрессорного воздействия использовалась иммобилизация в течение трех часов в клетке, ограничивающей подвижность животного и обеспечивающей фиксацию его головы с наружной стороны клетки. Перед стрессорным воздействием кролики голодали в течение 24 часов, а после воздействия получали корм. Кроликам 3 и 4 группы для коррекции стресса давали – капли препарата «Стоп-стресс» однократно в течение 5 дней. Его предварительно растворяли в небольшом количестве воды и вводили в ротовую полость шприцём в дозе: 1 капля препарата (5 мг по действующему веществу) на 1 кг массы тела.
Определение ферментативных активностей (мальтаза, щелочная фосфатаза) проводилось в различных отделах тонкой кишки через сутки после стрессорного воздействия.
Активности мальтазы (НФ 3.2.1.20) и щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1) определяли в гомогенатах слизистой оболочки тонкой кишки по описанным ранее методикам (Тимофеева и др., 1986; Егорова и др., 1986) и выражали в мкмолях продуктов гидролиза за 1 минуту на 1 г ткани.
Для установления наличия стресса у животных во всех опытах определяли уровень кортикостерона в плазме крови. Для этого через 20 мин после начала стрессорного воздействия у животных отбирали пробы крови (у крыс из хвостовой вены, у кроликов из ушной вены). Концентрацию кортикостерона в плазме крови измеряли флюориметрическим микрометодом (Балашов, 1990).
Экспериментальные данные обработаны статистически с использованием t-критерия Стъюдента при р<0,05.
