Введение к работе
профессор 1.
Актуальность темы
Современная селекция в птицеводстве базируется на отборе лучшего поголовья из высокопродуктивных семей и семейств и требует длительного времени. Одним из нетрадиционных подходов к генетическому улучшению птицы может стать трансгенез - внедрение в их геном инородных генов. Несмотря на методические трудности, работы по созданию трансгенной птицы как актуального направления в отрасли активно ведутся во многих странах, поскольку перспективны с точки зрения экономической выгоды, возможностью достижения эффекта селекции в короткие сроки. Трансгенез расширяет возможности получения животных с измененными признаками, многие из которых могут быть использованы в селекции, при этом отпадает необходимость длительных обратных скрещиваний для удаления из популяции «ненужных» генов, неизбежно передаваемых при обычной гибридизации. Очевидно, что методами трансгенеза могут быть введены в популяцию совершенно новые фенотипиче- ские признаки, кодируемые генами других видов и родов животных.
Дальнейшее развитие селекции и генетики сельскохозяйственной птицы предполагает разработку новых методов и приемов оценки генома, основанных на знаниях механизмов организации и функционирования живых организмов, в частности, механизмов яйцеобразования у кур. Процесс яйцеобразования связан со значительным усилением биосинтетических процессов в печени, где происходит синтез большинства желточных белков. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени кур по достижении ими репродуктивного возраста. С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую вителлогенную функцию без утраты предшествующих. Такая дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина и ЛОНП может быть вызван у цыплят введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормониндуцированную экспрессию «молчащих» генов, то есть последовательность процессов, приводящих к синтезу определенного белкового продукта, не синтезируемого ранее, а также определенные этапы этих процессов. Реализация генетической информации во многом зависит от рибосом, содержание которых определяет интенсивность белкового синтеза.
Активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондрион печени, обеспечивающий производство необходимого количества макроэргических соединений для анаболических процессов. Наличие в митохондриях собственного генетического материала обуславливает свои особенности во взаимодействии ядерного и митохондриального геномов в процессе развития и специализации органов и тканей.
Новые знания о сопряженности экспрессии вителлогенинового гена с биогенезом рибосом, митохондриальной энергетикой клеток печени и их использование будут способствовать максимальной реализации продуктивного потенциала у кур.
Цель и задачи исследований
Основной целью настоящей работы было изучение воздействия интегрированной генной конструкции, с геном гормона роста быка на биологические и продуктивные признаки генетически модифицированных перепелов, а также изучение гормональной экспрессии генов в печени цыплят.
В связи с указанным были поставлены следующие задачи:
получить трансгенных перепелов с встроенным геном гормона роста быка;
провести оценку экспрессии трансгена, биологических и продуктивных показателей трансгенных перепелов в ряду поколений: динамика роста и иммунный статус перепелов, гормональный статус крови, масса перепелиных яиц, их биохимический состав и морфологические показатели, яйценоскость;
изучить экспрессию генов на модели гормониндуцированного вителлогенеза у цыплят: синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, биохимические показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17-Р-эстрадиола и в зависимости от его дозы;
определить влияние гормональной экспрессии генов, вызванной 17-Р-эстрадиолом, на биогенез и биоэнергетические параметры митохондрий печени цыплят.
Научная новизна работы
Впервые проведена оценка экспрессии трансгена, генетический и фенотипический анализ трансгенных по гену гормона роста быка перепелов, полученных методом микроинъекции экзогенной ДНК в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
Впервые на примере трансгенных перепелов по гену гормона роста быка показана возможность существенного улучшения продуктивности птицы методами трансгенеза.
Впервые изучена сопряженность эстрогениндуцированной экспрессии вителлогенинового гена, выраженной в усилении синтетических процессов в печени и увеличении содержания вителлогенина, ЛОНП и триглицеридов в плазме крови с синтезом РНК и биогенезом рибосом в печени цыплят.
Выявлено, что синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности в печени эстрогенизированных цыплят имеют разные динамики, то есть относительно независимую регуляцию экспрессии соответствующих генов.
Обосновано, что необходимым условием для становления вител- логенной функции печени является синтез мРНК в первые часы после введения 17-Р-эстрадиола цыплятам. Биогенез рибосом определяет количественные характеристики ответа печени на гормон. Увеличение числа рибосом в печени после повторного введения эстра- диола цыплятам больше, чем после однократного.
Получены новые данные о том, что различия функционального состояния митохондрий печени кур-несушек и цыплят нивелируются в ходе эстрогениндуцированного вителлогенеза: в митохондриях печени цыплят происходят изменения параметров сопряжения и активного транспорта ионов кальция, которые приближаются к таковым в митохондриях печени кур-несушек.
Практическая ценность работы
Перепела опытной группы, потомки трансгенных по гену гормона роста быка, в ряду поколений сохранили превосходство по живой массе на 5-15% и массе яиц на 10-20% по сравнению с обычными, что свидетельствует о возможном практическом использовании трансгенеза в селекционной работе, направленной на повышение продуктивных показателей птицы в короткие сроки. Производственная проверка подтвердила результаты исследований. Разница по массе яиц перепелок трансгенного происхождения и эстонской породы составила 18,7%.
Материалы исследований легли в основу разработанного способа отбора перепелок по массе яиц (Патент РФ № 2402209). Результаты еженедельных взвешиваний яиц перепелок, отличающихся по средним показателям, с 7- до 50- недельного возраста позволили определить целесообразный возраст проведения оценки перепелок по этому признаку (11-12 недель). Именно в этом возрасте масса яйца соответствует средним показателям за весь период яйценоскости.
Выявленные у цыплят различия в динамике индукции синтеза вителлогенина и ЛОНП в ответ на введение 17-Р-эстрадиола являются обоснованием возможности раздельной селекции кур по этим признакам.
Линейная зависимость содержания фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят позволяет использовать каждый из них для ранней оценки яичной продуктивности кур. Использование в качестве показателя общего кальция из соображений методического характера является предпочтительным.
На основании изученных параметров окислительного фосфорили- рования и цитохромоксидазной активности митохондрий печени получено экспериментальное подтверждение оптимальным нормам кормления, режимам выращивания и содержания птицы (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988; Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), Методическое руководство для зоотехнических лабораторий (1998).
Основные положения, выносимые на защиту
В результате выполненных исследований и производственной проверки разработаны и выносятся на защиту следующие основные положения:
-
-
Экспрессии трансгена у перепелов, полученных методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста быка в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
-
Рост, продуктивность, гормональный статус крови, иммунный статус трансгенных по гену гормона роста быка перепелов и их потомков в ряду поколений.
-
Синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17-Р-эстрадиола и в зависимости от его дозы.
4. Интеграция гормональной индукции вителлогенной функции печени цыплят с биогенезом, активностью окислительного фосфо- рилирования и функциональной специализацией митохондрий.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на Ученых советах ВНИТИП в ежегодных отчетах 1980-2010 г.г.; на 11 Всесоюзном симпозиуме по биохимии митохондрий, Пущино (1981); на Всесоюзном симпозиуме по биохимии с.-х. животных, Витебск (1982); на научно-методической комиссии по селекции и генетике птицеводства Отделения животноводства ВАСХНИЛ (1983); на Всесоюзном биохимическом съезде, Киев (1986); на Всесоюзном симпозиуме «Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа», Ташкент (1986); на 2 Всесоюзном симпозиуме «Научные основы витаминного питания с.-х. животных», Юрмала (1987); на Всесоюзной научно-технической конференции «Эффективное использование кормов в птицеводстве», Новосибирск (1990); на Всесоюзной научной конференции «Использование физических и биологических факторов в ветеринарии и животноводстве», Витебск (1991); на Украинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы современного птицеводства», Харьков (1991); на международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных», С.-Петербург, Пушкин (1994); на ежегодных отчетах в отделении зоотехнии и животноводства РАСХН (1995-2005 г.г.); на научных конференциях «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва (1996, 2000 гг.); на II Международной выставке «Инновации-99. Технологии живых систем» Всероссийский выставочный центр, Москва (1999), где был присужден Диплом II степени за разработку «Получение трансгенной птицы»; на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России». С.Петербург (2008), на XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Достижения в современном птицеводстве: Исследования и инновации», Сергиев Посад (2009); а также за рубежом на 10 Европейской конференции по птицеводству, Иерусалим, Израиль (1998); на 6 Конференции Балтийских стран по птицеводству, Вильнюс, Литва (1998), на 8 конференции стран Балтии по птицеводству, Турку, Финляндия (2000); на 21 Международном конгрессе по птицеводству, Монреаль, Канада (2000).
Публикация результатов исследований
Основные результаты исследований опубликованы в трудах ВНИТИП, материалах Россельхозакадемии, республиканских и международных научных конференций, научных и научно-производственных журналах, информационной экспресс-информации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано 56 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, методическое руководство для зоотехнических лабораторий «Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы», 1998, получен патент РФ(2009 г.) на изобретение.
Научные исследования выполнены в соответствии с планом (1980-2010 гг.) Всесоюзного научно-исследовательского и технологического института птицеводства ныне ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии по темам: «Разработать методы прогнозирования яйценоскости кур с помощью введения в раннем возрасте экзогенных гормонов», № гос. рег. 81090364; «Разработка переносов генов в геном птиц» № гос. рег. 01980008817, «Разработать новые и усовершенствовать существующие методы получения трансгенной птицы с заданными признаками», № гос. рег. 01200120268; «Разработать методы получения генетически модифицированной птицы с ценными хозяйственными признаками», № гос. рег. 01200602327.
Объем и структура работы
Похожие диссертации на Трансгенез и экспрессия генов у сельскохозяйственной птицы
-
