Введение к работе
Актуальность проблемы. Серьезной проблемой современного
промышленного птицеводства являются заболевания, протекающие без ярко выраженных клинических признаков. К такой группе относится заболевание, возбудителем которого является утиный аденовирус, поражающий кур-несушек мясных и мясояичных пород в возрасте 24-32 недели. Данный вирус вызывает широко распространенное латентное заболевание кур-несушек, сопровождающееся снижением яйценоскости на 15-40 % и размягчением скорлупы яиц, что наносит огромный экономический урон птицеводческим хозяйствам. Со времени подробного описания болезни синдрома снижения яйценоскости - ССЯ (EDS - Egg drop syndrome-76), сделанного Eck и др., и открьпия самого вируса появились многочисленные сообщения о вспышках этой болезни во многих странах мира: Нидерландах, Северной Ирландии, Японии, Англии, Франции, Бельгии, Италии, США, Ираке и нашей стране. В настоящее время профилактика против данного вида заболевания осуществляется за счет применения комплекса санитарно-гигиенических мер, а также использования профилактических препаратов отечественного и зарубежного производства.
В настоящее время широко распространены вакцины, полученные традиционными методами (живые вакцины, инактивированные вакцины, субъединичные антигены и др.). Однако наиболее привлекательной для ученых всего мира является возможность получения живой генно-инженерной вакцины. Рекомбинантный вирусный либо бактериальный вектор, содержащий смысловой ген при введении в организм обеспечивает экспрессию необходимого количества антигена.
посколькуі свирус (і СЩ>
?.1-ЕЛИОПКА
В качестве векторов для экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro широко применяются- аденовирусы (Ад). Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии. В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе Ад животных, в частности, на базе генома аденовируса птиц 1 серотипа CELO. Данная векторная система представляется перспективной,
обеспечивает эффективную доставку генов в клетки птиц, которые являются для него пермиссивной системой, вирус не является патогенным для кур и не вызывает заболеваний при экспериментальном заражении. Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах, что позволяет осуществлять наращивание аденовируса в препаративных количествах.
Для практического применения вектора большое значение имеет высокая пакующая емкость генома CELO, а также возможность направленной модификации элементов капсида вируса для повышения тропности CELO по отношению к различным типам клеток.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание рекомбинантного вируса CELO, содержащего ген фибера вируса ССЯ-76 под контролем промотора цитомегаловируса человека и сигналом полиаденирования бычьего гормона роста, анализ экспрессии и антигенных свойств рекомбинантного белка, изучение гуморального иммунного ответа в организме лабораторных животных после введения им рекомбинантного вируса.
В процессе работы были поставлены следующие задачи:
-
Конструирование экспрессирующей плазмидной кассеты, несущей ген фибера ССЯ-76
-
Создание челночной плазмидной конструкции для получения вектора на основе аденовируса птиц CELO
-
Получение рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер
-
Получение и характеристика очищенного белка фибера ССЯ-76
-
Разработка иммуноферментной системы детекции антигена фибера вируса ССЯ-76.
-
Анализ экспрессии рекомбинантного антигена вируса ССЯ-76 в аллантоисе куриных эмбрионов, зараженных вирусом CELO-Фибер
7. Определение уровня специфических антител к фиберу ССЯ-76 в организме лабораторных животных при введении им рекомбинантного вируса CELO-Фибер.
Научная новизна. В результате проведенной работы впервые получен рекомбинантный вирус CELO- Fiber.
Создан банк плазмид, содержащих ген фибера в различных прокариотических и эукариотических плазмидных векторах.
Впервые получен препарат белка фибера ССЯ-76, очищенный методом двухстадийной гидрофобной хроматографии, определена его молекулярная масса и локализация в полипептидном спектре вируса ССЯ-76.
Разработана иммуноферментная система детекции антигена фибера вируса ССЯ-76.
В ходе работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена фибера, встроенного в геном CELO.
Показана индукция синтеза специфических, антител в организме лабораторных животных при инъекции рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер.
Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, но и предполагает возможность использования полученного рекомбинантного аденовируса СЕШ-Фибер для профилактики синдрома снижения яйценоскости у кур. Кроме того, векторы на основе CELO могут быть использованы для создания живых- генно-инженерных вакцин для профилактики других инфекционных заболеваний птиц.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из
введения, глав: «Обзор литературы» (55 стр.), «Материалы и методы» (20
стр.), «Результаты» (31 стр.), «Обсуждение результатов» (15 стр.), выводов и списка литературы, включающего 121 библиографическую ссылку. Работа изложена на 119 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 15 рисунков.
