Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время векторные системы на основе рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 (Ад5) являются одними из наиболее широко используемых средств доставки генетической информации в клетки млекопитающих и человека. К преимуществам таких векторов относятся: их способность проникать как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки; аденовирусная ДНК не встраивается в геном клетки-хозяина и остается в экстрахромосомной форме; аденовирусы могут быть получены в титре более 1010 БОЕ/мл, что позволяет использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин; и наконец, обеспечение высокого уровня экспрессии целевого гена в клетке-мишени.
Однако технология получения готового препарата аденовирусного вектора, в целом, а также сама векторная система на основе Ад5, в частности, не лишена недостатков. Наиболее существенными из них являются:
отсутствие технологически простой и эффективной методики очистки и концентрирования аденовирусного препарата, готового к непосредственному применению в медицине или ветеринарии;
невысокая эффективность трансдукции данными векторами некоторых типов опухолевых клеток человека и млекопитающих.
Устранение этих недостатков возможно путем конструирования рекомбинантных аденовирусов с модифицированным капсидом. Перспективным направлением модификации капсида аденовируса является модификация минорного кап-сидного белка IX (рГХ). Преимущества модификации pIX заключаются в следующем: возможность встраивания к С-концу pIX относительно крупных пептидных фрагментов, высокая структурная совместимость pIX с внедряемыми лигандами, широкий спектр возможных направлений использования модификаций pIX.
Проблема невысокой эффективности проникновения аденовирусного вектора в некоторые типы опухолевых клеток объясняется тем, что первичным рецептором для связывания вириона Ад5 с поверхностью клетки является коксакивирусный-аденовирусный рецептор (CAR), высокий уровень экспрессии которого имеют не все типы опухолевых клеток. В связи с высокими темпами роста количества онкологически больных людей и животных в последние годы, создание аденовирусного
вектора, эффективно доставляющего генетическую информацию в опухолевые клетки с целью противоопухолевой терапии и диагностики, является актуальной научной задачей.
В связи с широким использованием векторов на основе аденовирусов в научной практике и медицинских исследованиях, в настоящее время активно создаются GLP и GMP производства для получения препаративных количеств аденовируса. В этой связи особенно актуальной является не только задача конструирования и получения рекомбинантных Ад5, но и разработка эффективных методов очистки и концентрирования Ад5.
Существующие сегодня способы очистки рекомбинантных Ад5 обладают следующими недостатками:
в результате очистки аденовируса ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия получаемый вирусный препарат содержит высокие концентрации хлористого цезия (3.13-3.17 М), несовместимые для применения животным и человеку вследствие его токсичности;
использование для очистки рекомбинантных аденовирусов ионообменной и эксклюзионной хроматографии не позволяет использовать исходный клеточный лизат с аденовирусом, а сам способ очистки является многоступенчатым.
метод ультрафильтрации не может быть отдельно использован для очистки аденовирусного препарата из клеточного лизата, так как процесс ультрафильтрации не является абсолютным и не позволяет полностью освободиться от массы балластных белков.
В связи с вышеизложенным, наиболее удобным и эффективным представляется способ, позволяющий непосредственно использовать клеточный вируссодер-жащий лизат для очистки аденовирионов и получать чистый препарат аденовируса на выходе, готовый к применению. Разработка такого способа очистки рекомбинантных аденовирусов представляет самостоятельный научный интерес.
Цель исследований - создание рекомбинантных аденовирусных векторов с различными модификациями капсидного белка IX для усовершенствования очистки рекомбинантных аденовирусов и для повышения эффективности проникновения рекомбинантных аденовирусных векторов в опухолевые клетки.
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:
-
Получить калсид-модифицированные вирусные векторы на основе реком-бинантного аденовируса человека 5 серотипа, экспонирующие на поверхности капсида различные углевод-связывающие домены гликозилгидролаз в составе аденовирусного белка IX.
-
Определить способность полученных модифицированных аденовекторов с углевод-связывающими доменами специфически связываться с соответствующими полисахаридными субстратами.
-
Подобрать условия элюирования капсид-модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами, адсорбированных на полисахаридном субстрате, и разработать способ аффинной очистки модифицированных аденовирусов с углевод-связывающими доменами в препаративных количествах из культураль-ного препарата на полисахардных носителях.
-
Получить рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способные адсорбировать на поверхности рекомбинантные наноантитела.
-
Определить эффективность доставки генетической информации аденовек-торами с лейциновыми зипперами, нагруженными наноантителами против опухо-леспецифического рецептора СЕА, в опухолевые клетки in vitro.
Научная новизна. Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX целлюлозо-связывающие и декстран-связывающие домены. Доказано, что углевод-связывающие домены экспонированы над поверхностью капсидов полученных рекомбинантных аденовирусов, а для аденовируса с целлюлозо-связывающими доменами в составе pIX впервые показана способность специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.
Разработан новый способ аффинной очистки рГХ-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе. Показана высокая эффективность нового способа очистки аденовекторов в получении чистого, биологически активного препарата аденовируса.
Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несу-
щие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера. На моделях культур клеток аденокарциноми легких человека (линия А549) и карциномы толстой кишки человека (линия Liml215) показано, что рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноан-тителами против опухолеспецифического рецептора СЕА, способен к эффективному проникновению в опухолевые клетки человека CAR-независимым путем.
По результатам работы подана заявка на получение патента Российской Федерации № 2011123472/10(034727) от 09.06.2011 «Способ очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека» и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 05.07.2011 года.
Практическая значимость. Плазмидная технология модификации гена капсидного белка IX аденовируса человека серотипа 5 внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоц-развития России для получения рекомбинантных аденовирусов с различными модификациями белка IX. Коллекция полученных рекомбинантных аденовирусов: Ad5EGFP-pIX-CBD, Ad5EGFP-pIX-DBD и Ad5EGFP-pDC-zipper хранится в вирусном музее лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.
По результатам научно-исследовательской работы разработаны «Методические положения по использованию аффинной очистки в производстве рекомбинантных аденовирусных векторов с генетически модифицированным капсидным белком IX», утвержденные на заседании секции отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук «Ветеринарная биотехнология» (протокол № 2 от 20 октября 2011г.), которые могут быть использованы в научных, учебных и производственных целях.
Разработанный способ аффинной очистки векторных систем на основе pIX-модифицированных рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 используется в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России для очистки препаративных количеств рекомбинантных аденовирусных векторов.
Личный вклад соискателя. Автор непосредственно получил рекомбинант-ные аденовирусные вектора с модифицированным pIX, разработал и оптимизировал технологию очистки pIX-модифицированных аденовирусных векторов, исследовал проникающую способность модифицированного аденовектора с лещиновым зиппером в составе рГХ в опухолевые клетки человека, проанализировал, обобщил и интерпретировал полученные результаты, сформулировал выводы и рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии очистки и полученных аденовектров. Электронная микроскопия образцов аденовирусов была выполнена совместно с д.б.н. Диденко Л.В., а цитофлуориметрия клеточного материала - совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России).
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2009 и 2010 годы в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009, 2010), Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), IX Международном аденовирусном съезде (Венгрия, Добогоко, 2009).
Автор является победителем Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых ВУЗов Минсельхоза РФ по направлению «Биологические науки» (Москва-Брянск-Краснодар, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 5 - в сборниках международных конференций и конгрессов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (321 источник, из которых 5 отечественных и 316 иностранных). Работа содержит 9 таблиц и 27 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Рекомбинантные аденовирусные векторы, полученные с помощью эффективной технологии, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, и содержащие модифицированный капсидный белок IX с целлюлозо-связывающими доменами, способны экспонировать их на внешней поверхности капсида и специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы.
-
Новый способ аффинной очистки plX-модифицированных аденовирусных векторных систем с целлюлозо-связывающими доменами на целлюлозном носителе позволяет получать чистый, биологически активный препарат аденовируса.
-
Полученные рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера, способны специфически адсорбировать на своей поверхности рекомбинантные наноантитела с комплементарными последовательностями лейциновых зипперов на С-конце.
-
Рекомбинантный аденовирусный вектор с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора СЕА, более эффективно проникает в опухолевые клетки человека in vitro в сравнении с аденовирусом без наноантител на поверхности капсида.
