Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения Станишевский, Ярослав Михайлович

Введение к работе

Актуальность темы

В лабораторной практике для детекции иммунохимического анализа широко применяют реакцию латексной агглютинации (РЛА), с использованием диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд».

Такой способ определения отличается простотой исполнения, не требует специального оборудования и позволяет в течение короткого времени (3-7 мин.) провести визуальный учет результатов.

Преимущества полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов перед частицами биологического происхождения (бактерии, эритроциты и др.) к настоящему времени очевидны. Они состоят в возможности получения полимерных суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределением их по размерам, наличием функциональных групп на поверхности полимерных микросфер, способных ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда, сохраняющих устойчивость в растворе электролита на всех стадиях получения тест-систем и при хранении.

Практическое применение диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» ограничено отсутствием систематических исследований по выявлению факторов, позволяющих обеспечивать оптимальную конформацию биолигандов при их иммобилизации на поверхность полимерных микросфер, и соответственно высокую чувствительность РЛА.

Все это делает работы в этом направлении важными и актуальными.

Цель работы состояла в создании диагностических тест-систем «полимерная микросфера - биолиганд» для выявления антигенов (антител) при заболеваниях различной этиологии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Провести синтез полимерных микросфер с необходимыми физико- химическими свойствами, и оценить их пригодность для создания диагностических тест-систем.

Выбрать способ иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, обеспечивающий высокую активность диагностических тест-систем при выявлении антигенов (антитела) в реакции латексной агглютинации.

Создать диагностические тест-системы и апробировать их в диагностике заболеваний различной этиологии: иерсиниоза, сальмонеллеза, лептоспироза, инфекционного бронхита, аутоиммунных заболеваний и др.

Научная новизна

1. 1. Установлено, что при конструировании диагностических тест-систем важен выбор полимерного носителя, который должен наряду с прочным связыванием биолигандов, обеспечивать им достаточную конформационную подвижность для участия в реакциях молекулярного узнавания определяемого лиганда (антигена или антитела).

   2. Высказана научная гипотеза о том, что многоточечное взаимодействие биолиганда с поверхностью полимерных микросфер вызывает его конформационные перестройки в процессе иммобилизации (физической адсорбции или ковалентного связывания функциональных групп), что приводит к нарушению биологически активной конформации биолиганда и затрудняет взаимодействие его с определяемым антигеном (антителом).

   3. Предложена новая экспериментальная методика получения диагностической тест-системы на тиреоглобулин с использованием существующей компьютерной модели тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе, позволившая повысить чувствительность реакции РЛА с расширением границ титров.

   4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию тест-системы для выявления антигенов различной природы, заключающейся в использовании промежуточного биолиганда - протеина А, аффинно взаимодействующего с Fc-фрагментом иммуноглобулина G, таким образом обеспечивая доступность Fab- фрагментов для связывания с антигеном.

   5. Установлено, что при создании диагностических тест-систем, в которых концентрация определяемого биолиганда намного ниже концентрации биолиганда, иммобилизованного в поверхностный слой полимерных микросфер, необходимо часть поверхности полимерных микросфер экранировать другим белком, например альбумином.

   6. Созданные диагностические тест-системы апробированы на панели сывороток с различными патологиями заболевания: иерсиниозом, лептоспирозом, сальмонеллезом, инфекционным бронхитом, а также заболеваниями щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, Базедова болезнь и другие), и показана их высокая чувствительность и специфичность.

   Практическая значимость

   1. 6. 1. Практическая значимость работы заключается в том, что все ее основные результаты использованы для создания технологии получения диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд», наработке опытных партий, и их апробации при диагностике конкретных заболеваний.

         2. Разработан опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-05-2009), и технические условия (ТУ 9380-172-04868244-2009) на производство диагностической тест-системы «ПМ-глицин-ТГ» для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации (Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), г.Москва), и подготовлено регистрационное досье для регистрации в Минздравсоцразвития России на разработку диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину.

         3. Разработан и запатентован способ получения диагностической тест-системы для выявления антител к аденовирусам КРС методом РЛА (патент №2004121606/15 от 20.02.2006г.). Разработан и запатентован способ получения антительной тест-системы для постановки иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (патент №2380708 от 05.12.2008г.).

         4. Разработанные высокочувствительные и специфичные диагностические тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину, и вирусу инфекционного бронхита кур штамма Н120 были успешно апробированы в лабораторных и клинических условиях в Медицинском Радиологическом Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН), г.Обнинск; Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), г.Москва, 1120 Центральном Военном Клиническом Госпитале (ЦВКГ), Украинской Независимой иммунологической лаборатории, Авторской лаборатории, г.Львов.

         5. Материалы диссертационной работы вошли в курсы лекций и практических занятий по дисциплинам: «Основы биомедицинских технологий» для студентов 5-го курса обучающихся по специальности 070100 «Биотехнология» и «Полимеры в медицине и фармацевтике» для студентов 4-го курса обучающихся по направлению 5508800 «Химическая технология и биотехнология» (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ, г.Москва).

         Положения, выносимые на защиту:

         1. Комплексный методологический и экспериментальный подход к разработке высокочувствительных и специфичных тест-систем, на основе полимерных микросфер и специфических биолигандов, для использования в иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (РЛА).

         1. 6. 5. 1. Обоснование критериев выбора полимерных микросфер и методов их синтеза для использования в качестве носителей биолигандов при разработке тест-систем, работающих по принципу РЛА.

                  2. Пути иммобилизации биолигандов белковой природы с различной молекулярной массой: тиреоглобулина, иммуноглобулина G, желатина на поверхность полимерных микросфер, позволяющие обеспечить необходимое взаимодействие биолиганда с детектируемым антигеном (антителом).

                  3. Получение диагностических тест-систем для реакции латексной агглютинации, и практическую их апробацию при выявлении веществ- индикаторов: Yersinia enterocolitica серотип О3, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита, сывороточного фибронектина, и аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы, содержащихся в сыворотках крови с различными патологиями заболевания.

                  4. Опытно-промышленный регламент и технические условия на производство диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации.

                  Апробация работы

                  Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Десятой и Одиннадцатой научно-технических конференциях "Молодые ученые и аспиранты МГТУ" (Мурманск - 1999г, 2000г); Международных научно-технических конференциях "Наука и образование" (Мурманск - 2002г, 2003г, 2004г, 2005г, 2006г.); VI-й Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии" (Москва - 1999г); Международных научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва - 2000г, 2001г); I-ой и II-ой Всероссийских научных конференциях «Биомедицинские технологии» (Москва - 2003г, 2004г); Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", "Ломоносов-2002" (Москва - 2001г, 2002г); XXXVIII и ХХХІХ Всероссийских научных конференциях по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Москва - 2002г, 2003г); XII international conference surface forces (Звенигород-2002г); Международном симпозиуме «Фотография в XXI веке» (Санкт-Петербург - 2002г); II-ой Всероссийской конференции "Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах" «ФАГРАН-2004» (Воронеж -2004г); Международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Минск - 2004г); II-й Международной научно-практической конференции "Науковий потенціал світу" (Днепропетровск - 2005г); Первой научно- техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» (Москва -2005г); Международной научной конференции "Молекулярная и прикладная генетика" (Минск - 2005г); IX Украинском биохимическом съезде (Харьков - 2006г.); III Всеукраинской научно- практической конференции с международным участием «Биотехнология. Образование. Наука. Практика» (Харьков - 2006г.); Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург - 2007г.); IV Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку»

                  (Москва - 2007г.); 3 International Symposium on «Reactive Polymers in Inhomogeneous Systems, in Melts, and at Interfaces» (Dresden, Germany - 2007г.); V Польско-украинская конференция «Polymers of special applications» (Radom, Poland.-2008^); XII международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград - 2008г.); National Scientific-Technical Conference with International Participation "Actual problems of synthesis and creation of new biologically active compounds and pharmaceutical preparations" (Lviv - 2008г.); IV международной научно-практической конф. «Биотехнология. Наука. Образование. Практика» (Днепропетровск. - 2008г.); Украинской научно-практической конференции. (Харьков - 2009г.); Участие в II-ой специализированной выставке нано-технологий и материалов "NTMEX- 2005 " (Москва - 2005г) и на VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва -2007г) «Золотая медаль»; Участие в международной специализированной выставке «Мир Биотехнологии» (Москва -2007г); 4^th International Summer School «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology» (Refensburg, Germany - 2011г.)

                  Публикации.

                  По материалам диссертации опубликовано 78 печатных работы, из них 23 статьи, 1 учебное пособие, 1 учебно-методический практикум, 2 патента и 54 тезисов докладов. Личный вклад автора.

                  Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работы - от выбора направления, постановки конкретных задач, планирования и проведения ключевых исследований до анализа, обобщения и литературного оформления полученных результатов. Структура и объем работы

                  Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», Заключения, Выводов, Списка литературы и приложений. Материалы диссертации

                  изложены на страницах машинописного текста, включая таблицы,

                  и рисунков. Список литературы содержит работы.

                  Работа выполнена при участии НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН (лаборатория иммунологической диагностики эндокринных заболеваний), Российский Университет Дружбы Народов (кафедра микробиологии), МГУ им. М.В. Ломоносова (кафедра коллоидной химии).

                  Работа проводилась при поддержке Министерства образования и науки по программе: «Государственная поддержка региональной научно-технической политики высшей школы и развитие ее научного потенциала» по темам: «Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения» (2000г-2002г.); и «Нанотехнология иммобилизации биолигандов на полимерные микросферы для создания высокоспецифичных иммунореагентов» (2003-2004г.); а также при поддержке Министерства образования и науки РФ по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» № 2.1.1/12956 по теме: «Научные основы создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для биомедицинских исследований» (2009г- 2011г.).

                  Похожие диссертации на Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения

                  

                  Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных А- и В-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рициномГрачева Мария Андреевна

                  Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросферВолкова, Екатерина Владимировна

                  

                  Теоретическое и научно-методическое обоснование использования белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-системЗайцев Александр Алексеевич

                  

                  Биотехнология полигидроксиалканоатов : научные основы медико-биологического примененияШишацкая Екатерина Игоревна

                  

                  Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерийЗолотухин Сергей Николаевич

                  

                  Разработка биопрепарата и бактериологической тест-системы для типирования Bordetella BronchisepticaСверкалова, Дарья Геннадьевна

                  

                  Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собакРахманин Петр Владимирович

                  

                  Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методовПерепечаев Константин Андреевич

                  

                  Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителейВасиленко Надежда Филипповна

                  Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств специфической профилактикиБедоева Залихан Михайловна