Введение к работе
Актуальность темы
В области практической медицины наиболее востребованными являются диагностические тест-системы, имеющие высокую чувствительность и специфичность, и отличающиеся простотой постановки исследования, быстротой получения результатов, отсутствием необходимости в дополнительном аппаратурном оснащении и невысокой стоимостью проводимого анализа. Данным требованиям отвечают диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации.
При проведении серологических исследований для идентификации различных заболеваний широко используются диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Работа таких диагностикумов основана на протекании иммунохимической реакции между фиксированными на поверхность эритроцитов антигенами (антителами) и специфичными к ним антителами (антигенами), содержащимися в исследуемых образцах.
Производство РПГА тест-систем и обеспечение их устойчивости во время хранения сопряжено с рядом трудностей, вызванных применением в качестве носителей биолигандов эритроцитов. Эритроциты получают из крови млекопитающих или птиц, содержание которых на специализированных фермах является трудоемким и дорогостоящим. Являясь биологическим материалом, эритроциты трудно поддаются стандартизации при изготовлении диагностикумов.
Современным решением проблем, связанных с использованием эритроцитов, является их замена на полимерные микросферы и разработка на их основе диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации (РПЛА). Разработка латексного диагностикума для постановки серологического исследования в U-образных лунках требует определения не только оптимального количества иммобилизуемого на поверхность полимерного носителя биолиганда, но и нахождения оптимального размера и свойств самого носителя, значения которых определяются способом постановки реакции пассивной латексной агглютинации.
В связи с этим разработка диагностических тест-систем, работающих по принципу пассивной латексной агглютинации, остается актуальной проблемой биотехнологии.
Цель и задачи работы
Изучение реакции пассивной гемагглютинации с целью замены эритроцитов, применяемых в качестве носителей биолигандов, на полимерные микросферы.
Для достижения поставленной цели было необходимо:
изучить топохимию образования агглютината при протекании реакции пассивной гемагглютинации;
сформулировать критерии выбора полимерных микросфер для применения их в качестве носителей биолигандов при постановке реакции пассивной латексной агглютинации и на их основе провести поиск полимерных микросфер для исследования;
разработать диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции пассивной латексной агглютинации;
провести испытания диагностических тест-систем, созданных на основе полимерных микросфер, по основным клинико-диагностическим параметрам;
разработать метод увеличения чувствительности реакции пассивной латексной агглютинации путем модификации частиц носителя.
Научная новизна
Разработан новый метод анализа протекания реакции пассивной агглютинации в U-образных лунках. Впервые визуализированы и проанализированы особенности протекания РПГА. Показано, что эритроциты в объеме образца, содержащего и не содержащего специфические антитела, седиментируют индивидуально, а формирование агглютината происходит в процессе перемещения эритроцитов по поверхности дна U-образной лунки.
В ходе настоящего исследования были сформулированы требования к полимерным микросферам для замены ими эритроцитов в диагностических тест-системах, работающих по принципу реакции пассивной агглютинации.
Впервые получен новый тип частиц полимерного носителя, представляющий собой полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм с фиксированными на их поверхность полистирольными частицами со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм. Модификация поверхности полистирольных микросфер частицами малого диаметра приводит к увеличению их удельной поверхности.
Практическая значимость работы
Результаты, полученные при изучении протекания реакции пассивной гемагглютинации, могут стать основой при разработке тест-систем для
диагностики различного рода заболеваний методом реакции пассивной латексной агглютинации.
Создана диагностическая тест-система для определения содержания дифтерийного антитоксина в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации, которая на верифицированном банке сывороток показала высокую чувствительность и специфичность.
Предложен новый тип частиц полимерного носителя, применение которого в качестве носителя биолигандов позволяет на порядок увеличить чувствительность реакции пассивной латексной агглютинации.
Автор защищает:
новый метод наблюдения и анализа протекания реакции пассивной агглютинации;
особенности протекания реакции пассивной агглютинации в U-образных лунках;
результаты исследования РПЛА тест-системы для определения содержания дифтерийного антитоксина в сыворотках крови человека;
способ получения полимерного носителя с развитой удельной поверхностью.
Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы и состояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении экспериментов и обобщении полученных результатов.
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на научной секции ПАВ Научного совета по коллоидной химии и физико-химической механике РАН «Поверхностно-активные вещества в технологических процессах» (Москва, 2010), XVIII-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2011 (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи по теме диссертационной работы опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены
