Введение к работе
Актуальность проблемы:
є-Капролактам является сырьем для получения полимерных материалов (капрон, найлон-6), применяемых в различных областях промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта. Обратимость процесса получения поликапроамида приводит к тому, что продукты полимеризации всегда содержат определённое количество низкомолекулярных фракций олигомеров как линейных, так и циклических. Отходы производств капролактама и полимерных материалов в настоящее время подвергаются захоронению или сжигаются, что нецелесообразно с экономической и экологической точек зрения. Кроме того, широкое применение поликапроамида вместе с его низкой биодоступностью создаёт проблему утилизации капроновых изделий, пришедших в негодность. В связи с этим необходимо уделять внимание разработке экспресс-метода контроля, ориентированного на детекцию опасного уровня загрязнения и разрабатывать методы утилизации капролактама и его полимеров и олигомеров.
В настоящее время перспективными считаются методы биохимической диагностики загрязнения, в частности, биосенсорные методы, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров. Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя, где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора кюветного типа, основанного на иммобилизованных клетках штамма - деструктора Pseudomonas putida К14 и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку [Riedel К., 1989]. Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама - САР-плазмидами. К настоящему времени описан ряд САР-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика.
Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отбор наиболее активных в отношении исследуемых субстратов штаммов. Ранее немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий (на основании оценки их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов) [Beyersdorf-Radeck В., 1998]. Биосенсорный подход для экспресс-оценки окислительной активности штаммов микроорганизмов, в том числе с разным сочетанием «бактериальный хозяин -плазмида», является перспективным для исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды.
Вопрос о биотрансформации олигомеров капролактама изучен в меньшей степени. В литературе описан ряд бактерий, утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность деградации найлона-6 лигнинразрушающими грибами. Однако возможность применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов
производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем в настоящее время только исследуется.
Работа выполнялась при частичной поддержке гранта РФФИ 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности»; в рамках проекта ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годы» (Госконтракт 02.438.11.7021.), проекта аналитической программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП 2.1.1.7789). Автор работы является победителем Всероссийского конкурса инновационных проектов «Живые системы» в 2005 г. (г. Киров); победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2007 г. (г. Пущино).
Цель работы:
Выявление закономерностей аэробной деградации капролактама и его олигомеров бактериальными штаммами с помощью биосенсорного подхода и разработка макета биосенсора для определения капролактама в водных средах.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- создать лабораторную модель биосенсорной установки, позволяющую
проводить количественную оценку окислительной активности различных
бактериальных штаммов - деструкторов капролактама;
провести сравнительное изучение окислительной активности бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида» с использованием биосенсорной установки;
выявить корреляцию между параметрами градуировочных графиков, полученных с помощью биосенсоров на основе штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида», и удельными активностями ферментных систем in vivo этих бактериальных штаммов; предложить подход для экспресс-оценки окислительной активности микроорганизмов;
на основе наиболее активного штамма - деструктора капролактама разработать макет микробного сенсора (биосенсора проточно-инжекционного типа) для детекции капролактама в водных средах, определить его аналитические и метрологические характеристики;
применить разработанный макет биосенсорной установки для экспресс-оценки содержания капролактама в процессе его биологической утилизации в модельных системах и реальных образцах технологических вод и отходов производств;
показать возможность применения биосенсорного подхода в сочетании с другими физико-химическими методами для изучения процессов микробиологической трансформации олигомеров.
Научная новизна
Впервые показана возможность экспресс-оценки окислительной активности бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин -САР-плазмида» с помощью биосенсорного подхода. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама. Установлена корреляция между величинами удельной ферментативной активности исследуемых штаммов и параметрами градуировочных зависимостей микробных сенсоров. Выявлено, что процесс утилизации капролактама зависит в первую очередь от выбора штамма-бактериального хозяина САР-плазмиды.
Установлено, что селективность биосенсорного определения капролактама при проточно-инжекционном способе регистрации ответов сенсора выше, чем при кюветном способе.
Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров бактериальными клетками штамма Pseudomonas putida BS394, содержащего плазмиду биодеградации капролактама pBS268 - окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Установлено, что процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмиды pBS268.
Практическая значимость
Разработан и опробован на реальных образцах макет биосенсора проточно-инжекционного типа для анализа содержания капролактама в водных средах. Разработанный макет биосенсора характеризуется экспрессностью, высокой чувствительностью и селективностью и может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора. Оригинальность и практическая значимость разработки подтверждена патентом РФ.
Показана возможность применения биосенсорной системы для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида», что может быть использовано при создании эффективных биопрепаратов с высокой способностью к биодеградации капролактама и продуктов его полимеризации.
Выявленные закономерности процесса биодеградации олигомеров капролактама могут использоваться при создании биосенсоров для детекции олигомеров в водных средах и при разработке технологии биологической очистки отходов, содержащих эти соединения.
Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. {медаль конкурса); 11-м Московском международном салоне промышленной собственности «Архимед» в 2008 г.; Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (г. Москва) в 2006 г.; Всероссийском конкурсном отборе и конференции инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (г. Киров) в 2005 г.
{диплом победителя); IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в 2006 г.; Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология -современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пущино) в 2006 г. {диплом лауреата конкурса); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) в 2005 г.; Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -Наука XXI века» (г. Пущино Московской области) в 2005 г.
По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен 1 патент РФ.
Структура и объем работы
