Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
-
Значение льна-долгунца, достижения и перспективы 10 использования методов культуры клеток растений в селекции
-
Получение гаплоидов льна 15
1.2.1. Культура пыльников, как метод ускоренного получения генети- 17
^ чески выровненного селекционного материала
1.2.2. Влияние различных факторов на морфогенез льна в культуре 19
пыльников
1.3. Направления исследований в селекции на устойчивость расте- 21
ний льна-долгунца
1.3.1. Возбудитель фузариозного увядания льна-долгунца, его биоло- 24
'Ш гические особенности
-
Фитотоксины гриба F. oxysporum и их роль в патогенезе фуза- 27 риозного увядания
-
Изменения физиологических и биохимических признаков рас- 31 тений льна, инфицированных F.oxysporum
1.4. Использование тканевых и клеточных культур в селекции на 33
ja; устойчивость к фитопатогенам
1.4.1. Селективные факторы и системы отбора in vitro 36
^ЛАВ^\2у ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
4/УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМА И МЕТОДИКИ ПРОВЕ
ДЕНИЯ ОПЫТОВ
ф 2.1. Почвенные и агрохимические условия проведения исследова- 38
2.2. Исходный материал 39
Растительный материал 39
Штаммы возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца 41
F. oxysporum
Схема исследований 42
Методы исследований 44
Методы выращивания растений 44
Методики лабораторных опытов 46
ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА - ДОЛГУНЦА НА 52
ОСНОВЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ
В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ
Изучение влияния условий выращивания донорных растений 52
на каллусогенез пыльников льна
Морфогенетический потенциал in vitro пыльников льна- 60
долгунца в зависимости от стадии развития пыльцы
Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных геноти- 64
пов льна-долгунца
Питательная среда как индуктор новообразований 66
Получение растений-регенерантов из каллусной ткани и после- 73
дующая адаптация к почвенным условиям
Характеристика растений-регенерантов, полученных в культуре 77
пыльников по основным хозяйственно ценным признакам
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ FUSARIUM 81
OXYSPORUMF. LINIИ ЕГО МЕТАБОЛИТОВ НА
ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН ЛЬНА-ДОЛГУНЦА
Культурально-морфологические признаки используемых 81
штаммов возбудителя фузариозного увядания
Определение токсичности культурального фильтрата гриба 84
F. oxysporum при прорастании семян льна-долгунца
^ F. oxysporum при прорастании семян льна-долгунца
3. Влияние фузариевой кислоты на прорастание семян 88
льна-долгунца
ГЛАВА 5. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА 93
НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ
1. Влияние культурального фильтрата гриба F. oxysporum 94
на формирование и рост каллусной ткани различных
генотипов льна-долгунца
-
Развитие гипокотильных сегментов и каллусной ткани 96 на селективной среде
-
Клеточная селекция льна-долгунца на устойчивость 100 к фузариозному увяданию
-
Оценка растений-регенерантов, на инфекционно- 107 провокационном фоне и по хозяйственно ценным признакам
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 115
ПРИЛОЖЕНИЯ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ
Sh-2, LMK-3, LMA-1, A-22, A-22m - питательные среды; БА - 6-бензиладенин; НУК - нафтилуксусная кислота; ИУК - индолилуксусная кислота; N - азот; К - калий; Р - фосфор;
ф.к. - фузариевая кислота;
к.ф. - культуральный фильтрат.
Введение к работе
зуемых во многих отраслях промышленности.
Одной из главных задач селекции льна-долгунца является выведение новых, высокоустойчивых к болезням сортов, обладающих комплексом хозяйственно ценных признаков. Фузариозное увядание - наиболее вредонос- а ное заболевание льна-долгунца. Поражение этим патогеном только на 1% влечет за собой снижение урожая льноволокна на 0,6%, а льносемян - на
0,66% (Караджова, 1967; Корнеева, 1972; Мусиенко, Карпунина, 1985; Лоша-кова, 1999). Традиционная селекция на устойчивость к фузариозному увяданию остается на сегодняшний день длительным, трудоемким процессом, поскольку лен-долгунец имеет очень низкий коэффициет размножения, селек- '!) ция ведется на трудносовместимые признаки, а возбудитель заболевания яв- ляется пластичным почвенным патогеном.
Успешное решение этой проблемы во многом определяется применением, наряду с традиционными, новых методических подходов, позволяющих повысить эффективность селекционной работы в данном направлении. Перспективным является использование биотехнологических методов. Воз- i& можность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мута- ций отбирать в жестких селективных условиях клетки с искомыми признаками является одной из преимуществ использования клеточных технологий. Проведение работ по клеточной селекции позволяет создавать новые формы растений в 2-4 раза быстрее по сравнению с традиционными (Бутенко, 1999). Селекция растений на клеточном уровне используется для выделения расте- нам грибов (Harman, McCoy, Knous, 1984; Toyoda, Tanaky, Hirai, 1984; Миллер, 1989; Сидоров, 1990; Давыдова, 1991; Курчакова, 1994; Безденежных, Иванов, Давоян, 1997; Трошина, Асфандиярова, Максимов, 1998), засухе (Тучин, Васильева, Сахаджа, 1991), солям (McHugen, Swartz, 1984; Мазин, 1991; Беккужина, 1993, Рамжит, 1995) и другим антиметаболитам. Как правило, в качестве объекта исследований для проведения работ по клеточной селекции используют каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. При культивирование каллусных культур льна-долгунца на селективной среде были получены растения-регенеранты, устойчивые к фу-зариозному увяданию. Однако в последующих поколениях устойчивость не была закреплена (Курчакова, 1994). Наряду с выше перечисленными объектами могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эм-бриоидов. Так, культивирование пыльников яровой пшеницы на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия позволило получить соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, с повышенной солеустойчивостью (Беккужина, 1993). Рядом авторов было высказано предположение, что по реакции пыльцы на токсин можно определить чувствительность растения к грибам рода Fusarium и отбирать устойчивые формы. Такие работы были проведены на люцерне, кукурузе, сое (Mulchahy, Mulchahy, 1975; Rowe, Stortz, Gillette, 1985; Простакова, Бронштейн, Пока-заньева, 1991). Китайские ученые в 1986 г. сообщили об успешном использовании культуры пыльников для селекции на устойчивость к пирикуляриозу у риса (Zhongzhan et al., 1986). В то же время, культура пыльников может быть использована для работ по селекции на гаплоидном уровне, для получения стабильных гомозиготных линий. Опубликованы результаты исследований по регенерации гаплоидных растений на основе пыльников и микроспор льна (Sun, 1984; Sun, Fu, 1991; Nichterlein, Nikel, Umbach, Friedt, 1991; Poliakov, 1991). Однако широкое внедрение этого биотехнологического приема в практическую селекцию ограничивается низким выходом андроклинных структур. Многие авторы отмечают, что большое значение имеет состояние растения в момент эксплантации пыльников (Sunderland, 1971; Picard, Buyser, 1975; Heberle et al., 1977; Бутенко, 1981; Шамина, 1981). Поэтому вопрос ис- пользования культуры пыльников в селекции льна-долгунца на устойчивость к фузариозному увяданию является актуальным, а получение новых устойчивых к этому патогену форм льна-долгунца методом клеточной селекции -перспективным направлением.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы была разработка элементов биотехнологии получения линий льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию и имеющих комплекс хозяйственно ценных признаков, с использованием методов культуры пыльников и клеточной селекции in vitro.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: оптимизировать условия для повышения морфогенетической активности пыльников; исследовать культурально - морфологические признаки используемых штаммов возбудителя фузариозного увядания льна-долгунца и подобрать оптимальные условия культивирования гриба F. oxysporum с целью получения высокотоксичного культурального фильтрата; отселектировать из каллусных культур устойчивые к культуральному фильтрату патогена и фузариевой кислоте клеточные линии и получить из них растения-регенеранты, устойчивые к фузариозному увяданию; создать линии льна-долгунца, устойчивые к фузариозному увяданию и не уступающие по основным хозяйственно ценным признакам сорту-стандарту Алексим, представляющие интерес для селекционной практики.
Научная новизна. В результате проведенных исследований оптимизированы условия выращивания донорных растений льна-долгунца и состав питательных сред для культивирования пыльников с целью индукции каллу-согенеза и морфогенеза in vitro.
Впервые разработана и испытана селективная система с использованием фузариевой кислоты, позволяющая отбирать устойчивые к этому токсину клетки льна-долгунца in vitro, из которых с большей эффективностью можно получать растения-регенеранты, устойчивые к фузариозному увяданию. По- Р казаны различия, по способности клеток формировать каллус на селективной среде, в зависимости от степени устойчивости генотипов к фузариозному увяданию.
Данные исследования открывают новые возможности создания ценного исходного селекционного материала и перспективных линий льна-долгунца ^ для практической селекции.
Практическая значимость. Из восприимчивых к фузариозному увя данию сортов Славный 82, Belinka и линий Г 1351, Л-957-8-4 получено 37 растений-регенерантов, устойчивых к фузариевой кислоте. 22 из них, соглас но проведенной оценке на инфекционно-провокационном фоне, характеризо вались высокой устойчивостью к фузариозному увяданию. Эти линии по ос- # новным хозяйственно ценным признакам не уступали исходным формам и сорту-стандарту Алексим.
Наиболее изученные и практически ценные линии - БТЛ-10 и ПП-9, полученные в культуре пыльников и в результате клеточной селекции, используются в селекционном процессе ВНИИ льна, а семена этих линий переданы в «Национальную коллекцию русского льна»
Работа выполнена в лабораториях биотехнологии и иммунитета Всероссийского научно-исследовательского института льна в 1996-1997, 1999-2001 гг. под руководством д.б.н. Полякова А.В. и к.с.-х.н. Лошаковой Н.И.
