Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика томата как интродуцированной культуры для Российской Федерации и Республики Шри-Ланка 9
1.1.1 .История интродукции, регионы возделывания 9
1 1.2. Ботаническая и биологическая характеристики 10
1.2. Основные стрессовые факторы для томата 11
1.2.1. Абиотические стрессоры томата в Нечернозёмной зоне России и в горной зоне Республики Шри-Ланка 12
1.2.2. Биотические стрессоры томата в горной зоне Республики Шри-Ланка и в Нечернозёмной зоне России. 13
1.3. Генетический контроль устойчивости томата к основным биотическим стрессорам 17
1.3.1. Генетический контроль устойчивости к ВТМ. 17
1.3.2. Генетический контроль устойчивости к Phytophthora infestans (Mont) de Вагу. 19
1.4. Проблемы получения исходного материала с комплексной устойчивостью к стрессам 20
1.5. Молекулярное маркирование в селекции 21
1.6. Гаметная селекция на устойчивость к стрессам 27
1.7. Характеристика коллекции маркерных мутантов томата как инструмента для генетических исследований 30
2. Материал и методика исследований 34
2.1. Материал исследований 34
2.2. Методика исследований 38
2.2.1. Оценка устойчивости к ВТМ на искусственном инфекционном фоне. 38
2.2.2. Диагностика растительного материала на содержание фитовирусов. 39
2.2.3. cDNA-AFLPанализ 40
2.2.4. Оценка на естественном инфекционном фоне. 42
2.2.5. Оценка холодостойкости спорофита 43
2.2.6. Оценка холодостойкости микрогаметофита 44
2.3. Анализ наследования признаков стрессоустойчивости 45
2.4. Анализ сохранения комплекса хозяйственно ценных признаков 47
у гибридного потомства Fi - F3 47
3. Результаты исследований 48
3.1. Исследование эффективности генов устойчивости к абиотическому (холод) и биотическим (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani) стрессорам. Отбор образцов с комплексной устойчивостью к стрессам 48
3.1.1. Исследование экспрессии генов устойчивости к холоду у восприимчивого и устойчивого генотипов с помощью cDNA-AFLP. 48
3.2. Изучение влияния холодового стресса на стадии прорастания семени на сохранение/изменение селекционно ценных характеристик исходного материала томата 52
3.2.1.Влияние холодового стресса на морфологические параметры сеянца 52
3.2.2. Влияние холодового стресса на функциональные характеристики пыльцы 54
3.2.3. Влияние холодового стресса на проявление устойчивости к вирусу табачной мозаики. 59
3.2.4. Влияние холодового стресса на устойчивость к грибным заболеваниям в закрытом грунте 65
3.2.5. Влияние холодового стресса на продуктивность растений и качество плодов. 67
4. Сохранение признаков устойчивости к абиотичесим (холод) и биотическим (ВТМ) Стрессам в потомстве F, - F3 .71
4.1. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов Fi 71
4.1.1. Оценка холодостойкости спорофита 71
4.1.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита 72
4.1.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики. 73
4.1.4. Оценка фитофтороустойчивости 75
4.1.5. Оценка урожайности 77
4.2. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов F2 78
4.2.1. Оценка холодостойкости спорофита 78
4.2.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита 79
4.2.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики. 80
4.2.4. Оценка фитофтороустойчивости 82
4.2.5. Оценка урожайности 82
4.3. Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов F3 83
4.3.1. Оценка холодостойкости спорофита 83
4.3.2. Оценка холодостойкости микрогаметофита 84
4.3.3. Оценка устойчивости к вирусу табачной мозаики. 89
4.3.4. Оценка фитофтороустойчивости и устойчивости к серой гнили 93
4.3.5. Оценка урожайности 94
4.4. Анализ сохранения признаков устойчивости гибридным потомством F1-F3 95
Выводы 98
практические рекомендации 99
литература 100
приложение 118
- Характеристика томата как интродуцированной культуры для Российской Федерации и Республики Шри-Ланка
- Оценка устойчивости к ВТМ на искусственном инфекционном фоне.
- Исследование эффективности генов устойчивости к абиотическому (холод) и биотическим (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani) стрессорам. Отбор образцов с комплексной устойчивостью к стрессам
- Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов Fi
Введение к работе
Томат занимает первое место в мире среди овощных культур по возделываемым площадям в открытом и защищенном грунте - 4 млн га. Больше всего площадей томата в Китае - 974 тыс.га (ежегодное производство - 25 млн тонн), далее следуют Индия - 520 тыс.га (7,4 млн тонн), Турция -225 тыс. га (9 млн тонн), Египет - 180 тыс. га (6,3 млн тонн), США - 177 тыс. га (12 млн тонн). Россия стоит на 6-ом месте по площади (142 тыс. га) и на 11-ом по производству томата в год (1,82 млн тонн). В Республике Шри-Ланка ежегодно производится около 90 тыс. тонн плодов томата, урожайность составляет 91,7 ц/га (FAO, 2005).
Томат имеет важное народнохозяйственное значение как культура для функционального питания: при невысокой калорийности - 160-200 ккал/кг (Курганская и др., 2006) он содержит 4-8% сухого вещества, в котором сахара занимают 1,5-6% от общей массы плодов, белки - 0,6-1,1%, органические кислоты - 0,5%), крахмал - 0,07-0,35, минеральные вещества -0,6%; а также - каротиноиды, витамины В і , В2 , В3 , В5 , фолиевую и аскорбиновую кислоты (Пивоваров и др., 2002). Современная медицина рекомендует плоды томата в качестве лечебно диетического средства больным с нарушением обмена веществ, при пониженной кислотности желудочного сока, заболеваниях печени, сердечно-сосудистой системы и особенно в тех случаях, когда имеются нарушения процесса обмена калия в организме. Имеющейся в плодах холин понижает содержание холестерина в крови, предупреждает жировое перерождение печени, повышает иммунные свойства организма, способствует образованию гемоглобина (Мамедов и др., 2002).
Несмотря на высокую экологическую пластичность (Жученко, 1973), томат подвержен абиотическим и биотическим стрессорам, свойственным зонам рискованного земледелия России (Нечернозёмной зоне и др.) и горной зоне Республики Шри-Ланка (основной регион возделывания томата в этой
стране), которые могут вызывать значительные потери урожая (30-100%). Создание адаптированных к комплексу стрессовых факторов сортов и гибридов томата сохраняет свою актуальность и в настоящее время. Но сочетание в одном генотипе комплекса хозяйственно ценных признаков -основная проблема традиционной селекции. Решить эту трудную задачу возможно, разработав новую технологию селекции, включающую современные методы молекулярного анализа, гаметнои селекции, и используя биоресурсы томата, собранные в морфологически маркированных генетических коллекциях.
Цель исследований:
Создание технологии получения стрессоустойчивого исходного
материала томата, на базе молекулярно-генетического анализа и гаметнои селекции.
Задачи исследований:
1. Изучение устойчивости томата к абиотическому (холод) и
биотическому (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani Sor.) стрессорам с помощью молекулярно-генетического анализа и гаметнои селекции.
Отбор генотипов с комплексной стрессоустойчивостью к стрессам, и использование их в скрещиваниях.
Изучение сохранения признаков устойчивости к стрессорам в гибридном потомстве Fi - F3.
Научная новизна:
Установлено, что холодовой стресс на ранних стадиях спорофита
(воздействие на семена температурой 10С в течение 2-х недель) не влияет на морфологические показатели надземной части сеянца, но оказывает значимое влияние на длину корешка, что позволяет проводить отбор холодостойких генотипов по данному показателю.
Впервые показано, что гены устойчивости томата к ВТМ - Тт-1 и Тт-2а по-разному реагируют на холодовой стресс на ранних стадиях спорофита:
7 ген Тт-2а теряет свою эффективность, в то время, как защитный эффект гена Тт-1 сохраняется.
Выявлено, что низкотемпературный стресс на стадии микрогаметофита значительно ухудшает функциональные характеристики пыльцы у гибридного потомства F\ - F3.
С использованием генотипов разного географического происхождения показано, что растения томата могут адаптироваться к любой эконише при наличии генов устойчивости к абиотическим стрессорам (повышенным/пониженным температурам) и индукции температурного стресса на ранних стадиях онтогенеза.
Практическая значимость:
Разработана селекционная технология на базе молекулярно-
генетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов исходного материала томата с комплексной устойчивостью к абиотическому (холод), биотическим (Ph. infestans, Altemaria solan/ Sor.) стрессам, высокой продуктивностью и жизнеспособностью пыльцы: Craigella Tm-1/Tm-l, Mobaci (коллекция лаборатории гаметных и молекулярных методов селекции ВНИИССОК), №5173, (коллекция ВНИИР им. Н.И. Вавилова), Тилина, Ражита (интродуцированы из Республики Шри- Ланка), Glossy 389 (из Таиланда), Дубок (лаб. селекции и семеноводства пасленовых культур ВНИИССОК). Образцы Craigella Tm-J/Tm-1, №5173, Mobaci, Mo 409, Mo 463 обладают к тому же устойчивостью к ВТМ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Холодовой стресс на ранних стадиях онтогенеза оказывает влияние на рост корешка у сеянца томата и эффективность гена Тт-2а устойчивости к ВТМ при сохранении основных морфо-биологических и функциональных параметров растения, включая эффективную защиту
8 гена Тт-1 устойчивости к ВТМ и функциональные характеристики пыльцы. 2. Технология получения исходного материала томата с комплексной устойчивостью к стрессам, разработанная на базе молекулярно-генетического анализа и селекции по микрогаметофиту, с помощью которой получено 7 образцов с комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам и высокой жизнеспособностью пыльцы.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характеристика томата как интродуцированной культуры для Российской Федерации и Республики Шри-Ланка
Томат относятся к семейству пасленовые (Solanaceae Pers), включающему около 80 родов и свыше 2000 видов (Алпатьев, 1981). Ботанический вид томата Lycopersicon esculentum Mill по классификации Д.Д. Брежнева (1954), (новое видовое название томата - Lycopersicon lycopersicum (L.) Karst ex Farwell), состоит из трех подвидов: subsp. pimpinellifolium - дикий, subsp. subspontaneum - полукультурный и subsp. cultum - культурный.
Большинство столовых и консервных сортов и гибридов томата относятся к подвиду cultum, в который входят разновидности vulgare -обыкновенный, validum - штамбовый и grandifolium - крупнолистный (Алпатьев, 1981).
Томат - светолюбивая и теплолюбивая культура, которая в первоначальный период развития требует освещения не менее 10 тыс. лк., а для формирования и налива плодов не менее 4 тыс. лк. (Бровко, 2003).
Стебли - округлые, но с возрастом становится угловатыми. В зависимости от характера роста и развития побегов сорта томата подразделяются на две группы: индетерминантные - с неограниченным ростом и детерминантные - с ограниченным ростом.
Корневая система хорошо развита. У индетерминантных сортов выделяется главный стержневой корень, у детерминантных корневая система более компактная. Листья очередные, непарно-перисторассеченные, резко различающиеся по структуре. Соцветие - завиток. Цветки томата самоопыляющиеся, но при жаркой и ветреной погоде возможно переопыление. В южных районах перекрёстное опыление достигает 4-5% (Матвеев и др., 1978).
Температура - важный фактор в производстве томатов, которые особенно чувствительны к низким вечерним температурам. При повышении температуры до 25С урожай плодов значительно увеличивается (Мошков, 1966). При более высокой температуре (30-31 С) и низкой относительной влажности воздуха фотосинтез почти прекращается (Крутилин и др. , 1951). Оптимальная дневная температура для роста и развития томата составляет: до плодоношения 18-22 С, в период плодоношения - 20-26С; оптимальная ночная температура на 5-7С ниже дневной (Ващенко и др., 1974). Для хорошего завязывания плодов требуются температуры не ниже 13С, так как при 10С рост пыльцы приостанавливается. При температуре 35-45С и выше пыльца становится стерильной (Балина, 1977).
Томат может выращиваться на различных типах почвы, но глубокая, глинистая почва, хорошо-высушенная и снабженная органическим и минеральными удобрениями является самой подходящей. Качество томата улучшается при возделывании на слабо кислой почве (рН 6,2-6,8).
Семена культурных форм томата плоские, яйцевидной формы, с заострением, желтовато серые, опушенные. Оптимальной температурой почвы для прорастания семян томата является 21-24С (Work, 1952).
Пыльцевые зерна размером 22-27 мкм, по форме - от почковидных до овальных, сравнительно тяжёлые. Оптимальной температурой для прорастания пыльцы томата является 29,5С (Smith, 1935).
Томат требует низкую относительную влажность воздуха (60-65%) и высокую влажность корнеобитаемой среды, то есть отличается высоким водопотреблением. При выращивании рассады томата от посадки до начала плодоношения оптимальная влажность грунта должна быть 70-75% ППВ, а в период плодоношения - 75-85% (Бровко, 2003).
Растения томата выносят большое количество элементов питания из почвы. Больше всего томат выносит калия, затем азота; фосфорной кислоты это растение поглощает в два раза меньше, чем азота, и в пять раз меньше, чем окиси калия (Матвеев и др., 1978).
Томат по происхождению является тропической культурой, и большинство генотипов страдает прежде всего от абиотических стрессов - от
повреждений холодом при температуре около 10С и ниже. Длительное воздействие температуры ниже 6С может приводить к гибели растений, а при менее длительном замедляется рост. При температуре ниже 13С завязывание плодов прекращается. В то же время излишне высокая температура (выше 30С) ограничивает урожайность томата. Наиболее существенным влиянием высокой температуры является снижение или прекращение завязывания плодов из-за разницы в фотосинтезе и переносе веществ, а также недостаток жизнеспособной пыльцы и удлинение столбика пестика. В зависимости от генотипа и условий окружающей среды, таких как влажность воздуха и почвы, температуры выше 34/20С (день/ночь) или 40С в течение 4ч вызывают опадение цветков у большинства сортов (Тепличный практикум, 2002).
Создание устойчивых к стрессовым факторам сортов и гибридов томата является одним из важнейших условий реализации их потенциальной продуктивности. Но при создании генофондов следует исходить из того, что не только каждый вид, но даже экотип и биотип уникален по своим приспособительным реакциям к конкретным условиям внешней среды.
Оценка устойчивости к ВТМ на искусственном инфекционном фоне.
Семена образцов проращивали на увлажнённой дистиллированной водой фильтровальной бумаге в чашках Петри при 25С и 10С. Семена проращивали при 10С две недели (холодовой стресс). Для обеззараживания семян от инфекции, находящейся на поверхности семян, проводили протравливание 0,1% раствором марганцево-кислого калия (Юг КМГ1О4 на 1л воды) в течение 20-25 минут, затем тщательно промывали в проточной воде и высушивали.
Проклюнувшиеся семена высевали в деревянные ящики с дезинфицированной почвой в вегетационном боксе. В фазу семядольных листьев проводили заражение образцов ВТМ с предварительной обработкой листьев целитом. В качестве инокулюма использовали гомогенат листа системно инфицированного табака, разведённого в соотношении 1:20 (Квасников, Игнатова и др., 1984).
Визуальное обследование и диагностику по симптомам проводили по European Handbook of Plant Diseases (1988). При визуальной диагностике обнаружили следующие типы симптомов: обыкновенная (зелёная) мозаика, жёлтая мозаика, крапчатость, папоротниковидность, деформации листовой пластинки (морщинистость, пузырчатость).
Оценку проявления симптомов вирусной инфекции проводили на 21, 36 сутки после заражения и определяли степень распространения заболевания. Измеряли биометрические параметры растений (длина корешка, высота растения, площадь верхнего сегмента 3-4 настоящего листа, масса растения).
Относительную устойчивость к ВТМ определяли по наличию/отсутствию симптомов болезни, а также по депрессии биометрических характеристик растения (высота стебля, площадь верхнего сегмента третьего настоящего листа, масса надземной части) при стрессовых условиях относительно контроля.
Диагностику исследуемых растений на содержание вирусов табачной мозаики (ВТМ), Х-вируса картофеля (ХВК), У-вируса картофеля (УВК), в соке листьев проводили методом DAS-ELISA (Clark, Adams, 1977) с помощью диагностического набора, полученного из Биотехнологического центра ИКХ «Коренево» с моновалентными антисыворотками к ВТМ, ХВК, УВК. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали визуально.
Принцип метода ИФА заключается в образовании комплекса между антигенами белка оболочки вирусов, иммобилизованными на твердой поверхности, и меченными ферментом специфическими антивирусными иммуноглобулинами (антителами) с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом.
На первом этапе на поверхность лунок полистироловых плат сорбировали специфические антитела (lgG) к вирусным антигенам, затем отмывали избыток антител и вносили тестируемый образец, предположительно содержащий целевые антигены вирусов. После инкубации, приводящей к образованию первичных иммунных комплексов, отмывали несвязавшийся материал и добавляли в лунки конъюгат -ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела против вирусных антигенов, взаимодействие которого со свободными антигенами вирусов приводит к образованию на стенках лунок «сэндвича» антитело-антиген-конъюгат. После тщательной отмывки несвязавшегося конъюгата проводили ферментативную реакцию с субстратом, сопровождающуюся образованием окращенного продукта в том случае, если в образце содержались целевые вирусные частицы. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию тестируемого вируса в пробе и может быть выражена в единицах оптической плотности с помощью вертикального фотометра (ELISA-ридера) или визуально (по методике ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, 2006).
Исследование эффективности генов устойчивости к абиотическому (холод) и биотическим (ВТМ, Ph. infestans, Alternaria solani) стрессорам. Отбор образцов с комплексной устойчивостью к стрессам
Устойчивость сельскохозяйственных растений к стрессам имеет действительную селекционную ценность, если она является «длительной», т.е. сохраняется (хотя бы в течение непродолжительного периода): во времени (в последующих поколениях) в пространстве (в различных эколого-географических зонах).
Важной проблемой селекции считается сочетание в одном генотипе устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам. Следовательно, вопрос о соотношении этих типов устойчивости в индивидуальном генотипе и в популяции растений-хозяев при стрессе сохраняет свою актуальность.
Используя искусственный инфекционный фон дикого (природного) штамма ВТМ (условия лабораторного бокса) и молекулярное маркирование генов Тт-2/Тт-2а с помощью RAPD, И.Т. Балашова с коллегами в 2004г. установили присутствие генов устойчивости к ВТМ в коллекционном и селекционном материале томата, обладающим устойчивостью к холоду и Phytophthom infestansDB. Но в 2005г. Е.В. Пинчук с коллегами показала, что ген Тт-2а теряет свои защитные свойства при воздействии холодом на семена томата на стадии прорастания (Пинчук и др., 2005). Вероятно, холодостойкость томата - более «сильный» признак, чем устойчивость к вирусу.
Для того, чтобы проанализировать экспрессию генов, вовлеченных в ответную реакцию томатов на стресс холода и возможно отвечающих за механизм устойчивости к данному стрессу, был проведен cDNA-AFLP анализ двух образцов томатов, подвергнутых стрессу холода. РНК была . выделена из листьев двух, контрастных по устойчивости к холоду, образцов томата в контроле и после 24 часов обработки холодом. Дифференциально экспрессирующиеся фрагменты были получены с помощью селективной амплификации с использованием 5 комбинаций праймеров (см. Материалы и методы). cDNA-AFLP-образцы двух форм томата в контрольных и стрессовых условиях представлены на Рис. 2. Количество и длина амплифицируемых фрагментов (от 50 до 500 Ьр) варьировала в зависимости от комбинации праймеров. В общей сумме, примерно 700 амплифицируемых фрагментов было выявлено в двух образцах томата в контроле и в условиях стресса. Из всех амплифицированных фрагментов лишь небольшая часть (около 6,3%) продемонстрировала дифференцированную экспрессию у контрольного и стрессированного образцов, что можно рассматривать, как ответную реакцию на стресс. Из них около 20% показали строгую разницу в экспрессии между устойчивым к пониженным температурам образцом (L. esculentum var. racemigemm) и восприимчивым к холоду образцом (L. esculentum cv. Anath (Fa 189)) при стрессе холода.
Как видно из рисунка 2, образец экспрессии кДНК двух образцов томата можно разделить на следующие группы. К первой группе относятся фрагменты (большинство), экспрессия которых не менялась под действием холодового стресса ни у одного из образцов томата. Наиболее вероятно, что эти фрагменты представляют гены так называемого "домашнего хозяйства" (housekeeping genes), к которым относятся, к примеру, такие как 18S rRNA, tubulin, actin, NADHu многие другие гены.
К следующей группе можно отнести фрагменты, которые демонстрировали сходную экспрессию у обоих образцов томата под действием стресса. Например, фрагменты Ф5 и Ф7 увеличивали свою экспрессию в одинаковой степени как в устойчивом, так и в чувствительном к холоду образцу томата, в то время как фрагмент Ф17 демонстрировал одинаковое снижение уровня экспрессии под действием холода в обоих образцах. Наибольший интерес для дальнейшего изучения представляет собой третья группа фрагментов, отличающихся по уровню своей экспрессии между образцами под действием стресса холода. К ним, в первую очередь, относятся фрагменты, показавшие увеличение экспрессии у устойчивого к пониженным температурам образца (L. esculentum var. Yacemlgerum) под действием холода, в то время как у восприимчивого к холоду образца (L. esculentum cv. Anath (Fal89)) экспрессии этих фрагментов не наблюдалось (фрагменты Ф1, Ф2, ФЗ, Ф4, Ф8, Ф9, Ф12, Ф18 - см. Рис.2). Надо отметить, что у чувствительного томата также присутствовали фрагменты, экспрессия которых увеличивалась под действием холода (Ф13, Ф11, Ф10), но при этом таковой не наблюдалось у устойчивого образца. Однако, количество таких фрагментов было значительно меньше по сравнению с устойчивым образцом. К четвертой группе фрагментов можно отнести те, которые демонстрировали снижение экспрессии при стрессе либо только у устойчивого (Ф14, Ф15, Ф16), либо только у чувствительного образца томата (Ф19, Ф20,Ф21).
Таким образом, исследовав реакцию на холодовой стресс восприимчивого к холоду генотипа - Lycopersicon esculentum cv. Anath (израильской селекции) и устойчивого генотипа - L. esculentum var. racemigerum, мы убедились в том, что холодостойкость у томата контролируется полигенно и экспрессия генов устойчивости к холоду у резистентного образца при холодовом стрессе значительно выше, чем у восприимчивого. Следовательно, холодовой стресс - это достаточно мощный рычаг воздействия на геном, который может значительно изменить селекционно-ценные параметры растения.
Оценка стрессоустойчивости и продуктивности гибридов Fi
В популяции F2 наибольшей холодостойкостью характеризовались гибриды генотипов Fb семена которых подвергались холодовому стрессу. Из них наибольшую холодостойкость по всем измеряемым показателям проявил гибрид F2 Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Дубок, популяция которого была и наиболее однородна (табл.16). В целом холодостойкость всех гибридных образцов находилась на среднем уровне. По длине корня и по длине стебля у образцов F2 Craigella (Тт-1/Тт-Г) х Дубок и Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 как реакция на холодовой стресс отмечены незначительные изменения показателей (табл.16).
Наименьшая жизнеспособность пыльцы отмечена у образцов Craigella (Tm-2a/Tm-2a) х Дубок, Craigella {Tm-1/Tm-I) х Талалихин 186 . У остальных образцов пыльца была среднежизнеспособна (табл.17).
У образца Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186, холодовой стресс значительно стимулировал прорастание пыльцы. У образца Craigella (Tm-J/Tm-1) х Дубок под действием холодового стресса наблюдались незначительные различия по жизнеспособности микрогаметофита и длине пыльцевой трубки при низкотемпературном проращивании In vitro относительно контроля (табл.17). Поэтому эти образцы были выделены как высокохолодостойкие.
Для определения наиболее вирусоустойчивой гибридной комбинации F2 проводили искусственное инфицирование растений каждого образца. Для получения потомства F2, индивидуально отбирали растения из потомства Fj. Семена проращивали при пониженной температуре (+10С), для того чтобы вывить влияние холодового воздействия на устойчивость генотипов к ВТМ у сеянцев гибридов F2 Через 20 суток после заражения на гибридах F2 были отмечены слабые симптомы мозаичности. Полностью отсутствовали симптомы мозаики на стандартах вирусоустойчивости сортах Craigella (Tm-2a/Tm-2a), Craigella {Tm-1/Tm-I). На многих образцах и на Craigella {Tm-2a/Tm-2a) наблюдалась слабая деформация листьев или пузырчатость.
Через 35 суток после заражения увеличивается степень распространения мозаичности и деформации листьев. Полностью отсутствовали симптомы у сорта Craigella (Tm-1/Tm-l) и гибрида F? Craigella (Tm-1/Tm-l) х Талалихин 186. Наибольшей степенью развития заболевания характеризовались сорт Талалихин 186 и гибриды F2 Craigella (Тт-2а/Тт-2а) х Талалихин 186 , Craigella {Тт-2а/Тт-2а) х Дубок , Craigella {Тт-1/Тт-ї) х Дубок.
Измерение биометрических показателей растений через 20 (фаза 2-х настоящих листьев) и 35 (фаза 4-х настоящих листьев) суток после заражения выявило различную степень устойчивости гибридов F2 к вирусной инфекции (табл.18). Мы исходили из того, что показателем устойчивости растений к вирусным заболеваниям является отсутствие депрессии ростовых процессов у зараженных растений.
