Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Характеристика потосистемы 10
Краткая характеристика растения-хозяина - Lycopersicon esculentum L...10
Характеристика патогена 12
Биологические особенности 12
Пути распространения вируса 14
Особенности патологического процесса в системе «вирус - растение-хозяин - среда» 15
Симптомы поражения вирусом табачной мозаики 18
Штаммовый состав вируса табачной мозаики 20
1.1.3. Проблема устойчивости растений к патогенам 23
1.1.3 Л. Взаимоотношения растения и паразита 23
1.1.3.2. Защитные системы растений 24
1Л .3.2.1. Ингибиторы 25
IЛ .3.2.2. Локальная устойчивость 26
1.1.3.2.3. Системная устойчивость 27
1.1.3.3. Генетический контроль устойчивости кВТМу томата 28
Молекулярные маркеры 31
Гаметная селекция на устойчивость к стрессовым факторам 35
1.4. Характеристика фитофтороза и устойчивости томата к данному заболева
нию 41
2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ 45
2.1. Условия проведения исследований 45
2.1.1. Погодные условия вегетационных периодов 2003-2005 гг 46
Материал исследований 49
Методика исследований 50
Оценка устойчивости кВТМ на искусственном инфекционном фоне 50
Молекулярное маркирование признака устойчивости к ВТМ у селекционных и коллекционных образцов томата 52
Оценка образцов томата по комплексу признаков на естественном инфекционном фоне 52
Оценка холодостойкости 54
Анализ наследуемости признака устойчивости к ВТМ 56
Анализ характера расщепления гибридов F2 57
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 58
Отбор форм томата, устойчивых к ВТМ, на основе картирования генов 7т-2 и Тт-22. Анализ эффектов генов устойчивости к ВТМ 58
Оценка устойчивости коллекционных и селекционных образцов томата при моделировании искусственных стрессов 63
Оценка вирусоустойчивости маркерных образцов томата с относительной устойчивостью к холоду и расе То Ph. infestans DB 64
Оценка холодостойкости спорофита маркерных и селекционных образцов томата, отобранных на естественном инфекционном фоне ВТМ и Ph. infestans DB 69
Оценка стрессоустойчивости маркерных и селекционных образцов томата при моделировании низкотемпературного стресса и эпифитотии ВТМ 71
3.3.Оценка вирусоустойчивых коллекционных образцов по комплексу призна
ков 81
Устойчивость коллекционных образцов томата к наиболее распространённым вирусам 82
Оценка коллекционных образцов томата на устойчивость к фитофторозу
Холодостойкость коллекционных образцов томата по микрогаметофиту 85
Холодостойкость коллекционных образцов томата по спорофиту 88
Оценка скороспелости и урожайности коллекционных образцов томата.91
3.4. Оценка стрессоустойчиво сти и продуктивности гибридов V\
96
3.4.1. Наследование признака устойчивости к ВТМ гибридами F]
97
3.4.2. Холодостойкость по спорофиту родительских форм и гибридов Fi томата
102
3.4.3. Фитофтороустойчивость родительских форм и гибридов Fj
104
3.4.4. Скороспелость и урожайность родительских форм и гибридов F]
107
3.5. Оценка стрессоустойчивости гибридного потомства F2 Ill
Оценка вирусоустойчивости гибридного потомства F2 на искусственном инфекционном фоне 111
Характер проявления признаков стрессоустойчивости в потомстве F2
ВЫВОДЫ 121
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 122
ЛИТЕРАТУРА 123
ПРИЛОЖЕНИЕ 144
Введение к работе
Томат по занимаемым площадям и доле в валовом объёме урожая является, наряду с капустой и морковью, ведущей овощной культурой Российской Федерации (Дятликович, Дудоров, 1998). Основными стрессовыми факторами, экономически ограничивающими урожайность томата в Нечернозёмной зоне, считаются недостаточная теплообеспеченность и фитопатогены, наиболее вредоносна из которых фитофтора {Phytophthora infestans DB.). Нарастает также вредоносность вирусных инфекций.
В результате 85-летней селекционной работы в лаборатории селекции и семеноводства паслёновых культур ВНИИССОК получен ряд раносозреваю-щих, устойчивых к пониженным положительным температурам сортов и гибридных форм томатов для открытого грунта Нечернозёмной зоны, которые обладают толерантностью и к Ph. infestans DB. (Скворцова, Гуркина, 2000). Ал-патьев А.В. (1970, 1971) и Анфиногенов Г.В. (1971) отмечали, что понижение степени поражаемости вирусом табачной мозаики (ВТМ) у потомств отборов устойчивых к вирусу форм в значительной мере наследуется. Недавние исследования, тем не менее, показали присутствие вируса табачной мозаики в селекционном материале томата из плёночных (степень распространения — 5,33-37,5%) и остеклённой (степень распространения - до 100%) теплиц (Лахматова и др., 2000). Вредоносность вирусной инфекции выражалась в значимом снижении массы больных плодов (на 25% и выше) (Лахматова и др., 2000), снижении содержания минеральных веществ (марганца, меди, цинка - до 50%) (Bergman, Boyle, 1962), сухого вещества и витамина С в плодах (Лахматова и др., 2000). Под влиянием вируса снижается активность ауксинов, определяемая в экстрактах из листьев томата (Pavillard, 1952). Всё это свидетельствует о подавлении реакций неспецифической устойчивости в результате инфицирования ВТМ. А растения с общим пониженным потенциалом устойчивости легче подвергаются абиотическим и биотическим стрессам.
Профилактические меры защиты от вирусных инфекций при степени распространения заболеваний 30-100% обычно малоэффективны (Александров,
Боос, 1961; Сухов, 1965; Власов, 1967). Они должны в обязательном порядке дополнять генетический контроль заболеваний, который обеспечивают толерантные и устойчивые сорта (Вавилов, 1937; Рыжкова, 1941). Возделывание невосприимчивых сортов издавна считалось наиболее эффективным, надёжным и дешёвым способом сохранения урожая. По мнению Балашовой Н.Ы., Пивова-рова В.Ф. (1999), оно приобретает особую ценность в связи с решением актуальнейшей проблемы сегодняшнего дня — охраны окружающей среды, снижения пестицидной нагрузки. Однако односторонний подход к отбору только лишь с позиции максимальной устойчивости или максимальной продуктивности нередко не учитывает интегративной реакции растений на факторы среды (Балашова, Пивоваров, 1999). Взаимосвязь между устойчивостью к патогенам и к абиотическим факторам внешней среды позволяет проводить отбор на комплексную устойчивость, в результате которого получают адаптивные образцы (Балашова, 1986). Следовательно, отбор материала с комплексной устойчивостью к пониженным положительным температурам и патогенам (фитофторозу и ВТМ) должен быть перспективен.
Адаптивный потенциал растений контролируется набором генов, среди которых базисные гены устойчивости не всегда занимают ведущие позиции и проявляются в фенотипе исключительно в стрессовых ситуациях. Фенотипиче-ское проявление этих генов возможно с помощью моделирования стрессов в климокамерах и на искусственных инфекционных фонах. Но смоделировать природную нерегулируемую ситуацию практически невозможно. Поэтому сорта и гибриды, полученные на искусственно смоделированном инфекционном фоне, часто имеют пониженный адаптивный потенциал.
Решение проблемы возможно путём использования при создании исходного материала, помимо традиционной селекции, методов молекулярного анализа (в частности ДНК-маркерования признака устойчивости) и гаметной селекции.
ДНК-маркеры - фрагменты ДНК, соответствующие нуклеотидным последовательностям, которые входят в структуру агрономически важного гена или сцеплены с ним. ДНК-маркеры позволяют решать следующие задачи:
разграничивать специфическую и неспецифическую устойчивость и исследовать взаимодействие соответствующих локусов;
определять расовую специфичность отдельных генов и оценивать взаимодействие между генами устойчивости к патогенам, развитием растений и окружающей средой;
их появление нейтрально по отношению к фенотипу, не является тка-неспецифичным, их можно обнаружить на любой стадии развития растений.
Важное преимущество молекулярного маркирования признака устойчивости к патогенам состоит в том, что устойчивость хозяина можно спрогнозировать в отсутствии патогена, избежав, таким образом, испытания на искусственном инфекционном фоне. Тем самым не только ускоряется процесс селекции на устойчивость, но и повышается его биобезопасность.
Вот почему использование молекулярных маркеров, тесно сцепленных с генами устойчивости, позволяет проводить эффективный отбор устойчивых растений на самых ранних стадиях онтогенеза. Такие методы, получившие название MAS-технологий, активно используются рядом иностранных селекционных и семеноводческих компаний для сортовой идентификации и правовой защиты. Достоверность при этом гарантируется надёжностью маркирования конкретного признака уникальной системой ДНК-маркеров и технологий, разработанных для каждого конкретного случая (Хавкин, 1997; Ежова и др., 2002).
Гаметная селекция, как известно, представляет собой селекцию генотипов в половом поколении жизненного цикла растений. На ранних этапах репродуктивного развития возможен отбор генотипов, наиболее приспособленных к условиям внешней среды. Целенаправленное выведение наиболее адаптивных форм ещё на репродуктивных стадиях развития может способствовать ускорению селекционного процесса (Mulkahy, 1974; Жученко, 1980). Проведённые
8 многочисленные исследования в ряде научных учреждений привели к выводу, что создание сортов, сочетающих в себе высокую потенциальную продуктивность и экологическую устойчивость, принципиально возможно (Степанов и др., 1995). Так, отбор по пыльце на холодостойкость внедрён в селекционную практику лаборатории селекции и семноводства столовых корнеплодов ВНИИССОК. Получен патент на сорт репы японской Снегурочка, выведенный с использованием методов селекции по микрогаметофиту. Срок создания этого сорта сократился в 2 раза по сравнению с традиционной технологией (Балашова и др., 2005). Таким образом, использование методов пыльцевой оценки на устойчивость к нерегулируемым факторам среды даёт возможность создавать адаптивные к этим факторам среды формы сельскохозяйственных культур и в более короткие сроки (Беспалько, 1999).
Гаметофитный отбор устойчивых к пониженным температурам образцов томата в сочетании с молекулярным маркированием признака устойчивости к ВТМ у фитофтороустойчивых образцов значительно (в 2 и более раз) ускорит процесс создания сортов и гибридов томата с комплексной устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам.
Целью настоящей работы является создание исходного материала для селекции томата с комплексной устойчивостью к абиотическим (пониженные положительные температуры) и биотическим (ВТМ и фитофтороз) стрессорам на основе методов молекулярного анализа и гаметной селекции.
Для достижения цели ставятся следующие задачи:
1. Идентификация стрессоустойчивости селекционного и коллекционного
материала: а) с помощью молекулярных маркеров устойчивости;
б) при моделировании искусственных стрессов;
в) на фоне естественных стрессов.
Отбор форм с комплексной стрессоустойчивостью.
Изучение наследования гибридным потомством признаков устойчивости к стрессам.
Научная новизна работы заключается в разработке элементов системы ускоренной оценки комплексной стрес coy сто йчивости растений томата, которые включают RAPD-маркирование генов устойчивости к ВТМ, анализ эффектов генов устойчивости при моделировании искусственных стрессов, оценку холодостойкости образцов по микрогаметофиту и спорофиту. Кроме того, показано положительное влияние низкотемпературного стрессора на стадии прорастания семян на устойчивость растений томата к ВТМ.
Определена надёжность защитных эффектов гена Тт-22, контролирующего устойчивость томата к ВТМ на тканевом уровне, после воздействия низких положительных температур. Изучен характер наследования комплексной стрессоустойчиво сти в различных комбинациях скрещиваний с участием вирусо-устойчивых образцов с генами Тт-22 и Тт-1.
Практическая значимость работы заключается в отоборе 11 форм томата с комплексом признаков устойчивости к абиотическим и биотическим стрессорам Нечернозёмной зоны России для использования их в качестве исходного материала в селекции.
