Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. ДОСТИЖЕНИЯ В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРЫ ПОЧЕК И РОЖ
В НИХ Nat, К+-АТФ-АЗЫ 14
1.1. Ультраструктурная организация почек в норме . 14
Почечное тельце ..... 14
Канальцевый отдел нефрона 16
1.2. Я&1 Б^-АТФаза почек 21
Открытие,і свойства и электронномикроскопичес-кое выявление Na+, К*-АТазы 21
Na+, К"*"-АТФазная активность клеток нефрона и собирательной почечной трубочки 29
ГЛАВА 2. COBPEIvlEHHKE ВЗГЛЯДЫ НА ПАТОГЕНЕЗ ПОВРЕЖДЕНИИ
ПОЧЕК ПРИ НЕСОВМЕСТИМОЙ ГЕМОТРАНСФУЗИИ ... 33
Повреждения структуры почек и изменения локализации активности Na+, К^АТФазы в клетках нефрона при несовместимой гемотрансфузии 33
Патогенез повреждений почек при несовместимой гемотрансфузии 38
Теория гипоксии . . . 40
Коагуляционная теория патогенеза повреждений структуры и функций паренхиматозных органов . 42
СОБСТВЕННЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ....... 48
стр.
Постановка экспериментов 48
Забор и проводка материала для электронной микроскопии 48
Забор и проводка материала на предает выявления локализации Na+, К^-АТФазной активности на ультраструктурном уровне 50
Условные обозначения к рисункам и подписям рисунков 51
ГЛАВА 4. УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ Na+tK+-
АТШ-АЗЫ КЛЕТОК НЕшРОНА И СОБИРАТЕЛЬНОЙ ПОЧЕЧНОЙ
ТРУБОЧКИ ИНТАКТНЫХ БЕЛЫХ KffiC 54
Ультраструктура и активность Na+, К*-АТФазы клеток почечного тельца 54
Ультраструктурная организация и активность Na+, К*"-АТазы канальцевого отдела нефрона 58
Ультраструктура эпителиоцитов проксимальной части канальца нефрона и активность их Na , К*"-АТ1 азы . 60
Ультраструктура эпителиоцитов дистальной части канальца нефрона и активность nxNa , К^-АТФазы . 73
Ультраструктура эпителиоцитов собирательной почечной трубочки и активность их Na , КГ^-АТФазы . 77
4.3. Идентификация локализации Na , К*-АТЗ>азы на
ультраструктурном уровне в клетках нефрона и соби
рательной почечной трубочки 83
РЕЗЮМЕ 85
стр.
ГЛАВА 5. ИЗШНЕНЙЕ УЛЬТРАСТШШ'Ш И АКТИВНОМ Na+, Кч~-АТё-АЗН КЛЕТОК НЕФРОНА Н СОБИРАТЕЛЬНОЙ ПОЧЕЧНОЙ ТРУБОЧКИ ПРИ НЕСОВМЕСТИМОЙ ГЕМОТРАНЖЗИЙ . . 87
Изменения ультраструктуры почечного тельца при несовместимой гемотрансфузии 88
Изменение ультраструктуры и активности Na , к*"-АТФазы эпителиоцитов проксимальной части канальца нефрона при несовместимой гемотрансфузии . . 92
Изменение ультраструктури эпителиоцитов дис-тальной части канальца нефрона при несовместимой гемотрансфузии ИЗ
Изменение ультраструктуры эпителиоцитов собирательной почечной трубочки при несовместимой гемотрансфузии 117
РЕЗЮМЕ 121
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА УЛЬТРАСТРУІСШУ И АКТИВ -
НОСТЬ Na+, 1Г-АТФ-АЗЫ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
ПРОІССЖУІАЛЬНОй ЧАСТИ КАНАЛЬЦА НЕФРОНА КРЫС ... 122
РЕЗЮМЕ 129
ГЛАВА 7. ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКШЫ И АКТИВНОСТИ Na+, К*-АТФ-АЗК КЛЕТОК НЕФРОНА И СОШРАТЕЛЬНОй ПОЧЕЧНОЕ ТРУБОЧКИ ПРИ НЕСОВМЕСТИМОЙ ГЕМОТРАНСФУЗИИ В УСЛОВИЯХ ПРЕДВАРИТЕ]]ЬЮГО ВВЕДЕНИЯ ГЕПАРИНА ... 130
Ультраструктура клеток почечного тельца при несовместимой гемотрансфузии на фоне предварительного введения гепарина 131
Ультраструктура и активность На » К*~АТФазы
стр.
эпителиоцитов проксимальной части канальца нейро
на при несовместимой гемотрансфузии на фоне пред
варительного введения гепарина 133
Ультраструктура эпителиоцитов дистальной части канальца нефрона при несовместимой гемотрансфузии на фоне предварительного введения гепарина .... 144
Ультраструктура эпителиоцитов собирательной почечной трубочки при несовместимой гемотрансфузии на
фоне предварительного введения гепарина .... 146
РЕЗЮМЕ 150
ГЛАВА 8. ЗАШШШТЕЛЫБЙ АНАЛИЗ 151
Активность Na+, К^-АТФазы в различных клетках нефрона в норме 152
Изменения На+» К^-АТШазной активности и ультраструктуры клеток нефрона и собирательной почечной трубочки в условиях генерализованного деком-пенсированного тромбиногенеза 160
Активность Na , К^-АТФазы и состояние ультраструктури клеток нефрона после несовместимой гемотрансфузии на фоне предварительного введения гепарина 164
Механизм снижения активности На , К*"-А1Фазы и повреждений ультраструктуры клеток нефрона при несовместимой гемотрансфузии 166
ВЫВОДЫ 167
ПРАКТИЧЕСКИЕ ШССЖЕВДАЩИ 169
ЛИТЕРАТУРА 170
ПРИЛОЖЕНИЕ 196
Введение к работе
Актуальность темы. Выяснение механизма повреждения структуры и функции клеток и органов при различных патологических состояниях было и остается одной из наиболее актуальных проблем биологии и медицины, ибо только познание этого механизма во всех его деталях позволит решить вопрос об эффективной профилактике и терапии этих повреждений.
До последнего времени общепринятым было мнение, согласно которому причиной поврежедений клеток при различных патологических процессах является циркуляторная гипоксия. В связи с этим очень многие ученые решение данной проблемы видели в выяснении механизмов микроциркуляции как в норме, так и при патологии. Однако, за последние годы в литературе накопилось ряд весьма веских данных, свидетельствующих против ведущей роли гипоксии в патогенезе повреждений клеток при многих заболеваниях и, в частности, при несовместимой гемотрансфузии /В.Т.Слонская,1978; И.П.Кокодыняк, I982;Q.Munck,I958;C.Brun,O.Munc^I972/.
С другой стороны, за последние два десятилетия очень интенсивно изучается роль генерализованных расстройств коагуляционной системы /диссеминированного внутрисосудистого свертывания/ в патогенезе самых разнообразных патологических процессов /С.М.Мартынов, 1959; Б.И.Кузник,1965; М.С.Мачабели,1970; Я.И.Выговская, 1971; Б.Й.Кудряшов,1975; Г.В.Андреенко,1979; Е.И.Дзись,1983; D. Мс Kay, 1965/. Однако после установления наличия и функционирования тромбин-плазминовой системы не только в крови и межуточной соединительной ткани, но и в каждой клетке организма как регулятора конформации белков по принципу денатурация*=± ренатурация /В.А.Монастырский,1969-1982; В.А.Монастырский, С.М.Мартынов и
_ 7 -
И.П.Дзись - заявка на открытие Р ОТ-9960/ открылись принципиально новые возможности для изучения механизма повреждений клеток. Исходя из этой концепции, многочисленными экспериментальными исследованиями было установлено,, что не только диссеминирован-ный микротромбоз, но и дезорганизация межуточной соединительной ткани и дегенеративные изменения клеток при несовместимой гемо-трансфузии имеют коагуляционный генез /В.А.Монастырский,1972, 1979/.
Согласно коагуляционной теории патогенеза повреждений клеток, в основе начальных их проявлений лежит обусловленная тромбином значительная денатурация различных клеточных белков. Если это действительно так, то денатурация апоферментов должна повлечь за собой изменение /снижение/ активности различных ферментов, например, Na+i К+-АТФазы. Однако, насколько это можно судить по данным литературы, это предложение еще никем не проверялось.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось выяснить на примере изучения Na+, К+-АТа>азы роль де-компенсированного тромбиногенеза в механизме нарушений активности ферментных систем клеток.
Для достижения этой цели в работе поставлены следующие конкретные задачи:
а/ с помощью методов ультраструктурной цитохимии изучить распределение активности Na+, К+- АТФазы в клетках почечного тельца, проксимальной и дистальной части канальца нефрона и собирательной почечной трубочки, а также провести ее корреляцию с ультраструктурной организацией данных клеток;
б/ изучить в динамике ультраструктуру и локализацию активности На+, К+- АТФазы при повреждениях клеток коагуляционного ге-неза, вызванного вливанием животным больших доз гетерогенной
крови;
в/ изучить в динамике ультраструктуру и локализацию активности Na+, К+-АТФазы клеток нефрона и собирательной почечной трубочки в условиях внутривенного введения животным гепарина в средних дозах;
г/ изучить в динамике ультраструктуру и локализацию активности На+, К+-АТазы клеток нефрона и собирательной почечной трубочки при массивной гетерогемотрансфузии в условиях предварительного введения гепарина.
Материал и методы исследования. Исследования проведены на белых крысах-самцах, у которых воспроизводили синдром генерализованного декомпенсированного тромбиногенеза с помощью массивной гетерогемотрансфузии без лечения и с предварительным введением гепарина. В динамике животных умерщвляли и производили забор материала /почечное корковое вещество/ для электронной микроскопии. Использован метод обычной электронной микроскопии и одна из методик цитохимии, а именно способ выявления локализации ка+, к+-АТФазы на ультраструктурном уровне.
Научная новизна работы. Установлено, что на всем протяжении нефрона и собирательной почечной трубочки выявляются клетки трех типов: "светлые", "темные" и "промежуточные". Показано, что активность Na+f К+- АТФазы находится в зависимости от электронной плотности клеток: в "промежуточных" она обнаруживается в плазмо-лемме, наружной ядерной мембране и фибриллярных структурах ядрышка, тогда как в аналогичных структурах "светлых" и "темных" клеток ее активность весьма низкая, либо вовсе отсутствует.
Впервые установлено, что в условиях генерализованного декомпенсированного тромбиногенеза, вызванного массивной трансфузией
- 9 -несовместимой крови, активность ^а+,К+-АТФазы в клетках нефрона резко снижается. Гепарин, введенный перед трансфузией несовместимой крови, ингибируя тромбиногенез, предупреждает снижение активности данного фермента.
Теоретическая ценность. Установленная зависимость активности Na , К -АТФазы различных клеток нефрона и собирательной почечной трубочки от их электронной плотности и от сдвигов в тромбин-плаз-миновой системе составляют теоретическую значимость работы.
Практическая ценность. Полученные данные о ведущем значении генерализованного декомпенсированного тромбиногенеза, обусловленного массивной трансфузией несовместимой крови, в механизме повреждений ультраструктуры клеток нефрона, резкого снижения активности их Na+, Iv-АТФазы, а также данные о возможности предотвращения этих повреждений гепарином могут быть использованы при разработке патогенетически обоснованных методов профилактики и терапии повреждений почек и развития острой почечной недостаточности.
В процессе выполнения работы разработаны и модифицированы некоторые методики и внедрены в практику ряда научных учреждений города Львова.
Результаты исследований. Проведенными исследованиями установлено, что в клетках нефрона и собирательной почечной трубочки интактньтх крыс Na , К^-АТФазная активность локализуется в мембранных структурах клеток, а именно, в самой плазмолемме или ее внутреннем осмиофильном слое. Помимо плазмолеммы она выявляется еще и в наружной ядерной мембране и фибриллярных структурах ядрышка.
Контрольные опыты подтвердили специфичность данной реакции и указали на то, что в базо-латеральной плазмолемме и наружной ядер-
ной мембране клеток аденозинтрифосфатазная активность представлена в основном Na+, К+- АТФазной компонентной, тогда как в латеральной плазмолемме и фибриллярных структурах ядрышка - Mg2+-АТФазной.
Различные клеточные элементы почечного коркового вещества и собирательной почечной трубочки имеют неодинаковую Na+, К+-АТФазную активность. В отношении же клеток почечного тельца и собирательной почечной трубочки, то во многих из них данная активность вовсе отсутствует или выявляется в незначительных количествах, тогда как в эпителиоцитах проксимальной и дистальной части канальца нефрона выявляется в больших количествах.
Кроме этого нами обнаружена еще одна, на наш взгляд очень важная закономерность, а именно - зависимость активности Na+, К+-АТШазы от электронной плотности клеток. Нашими исследованиями, которые в основном согласуются с данными литературы, установлено, что на всем протяжении нефрона встречаются клетки, которые в зависимости от электронной плотности можно разделить на три типа: 1-ый тип - это клетки с низкой электронной плотностью и которые в литературе получили название "светлых" клеток; 2-ой тип - это клетки с весьма высокой электронной плотностью, они получили название "темные" клетки, и, наконец, 3-ий тип, к которому относятся подавляющее большинство клеток, это клетки со средней электронной плотностью, и их обычно называют "промежуточными" клетками.
Основным ультраструктурным различием в клетках данных типов является соотношение гиалоплазма /органеллы. В "светлых" клетках данное соотношение сдвинуто в сторону гиалоплазмы, а "темных" - в сторону органелл, тогда как в "промежуточных" от-
- II -
сутствует заметное преобладание органелл или гиалоплазмы.
Надр отметить, что четких границ между группами "светлых", "темных" и "промежуточных" клеток нами не выявлено, то есть, между ними выявляется ряд промежуточных форм.
Оказалось, что максимальной активностью На+, к*-АТ$азы обладают так называемые "промежуточные" клетки. По мере же увеличения электронной плотности клеток или наоборот, уменьшения их электронной плотности, происходит уменьшение активности Na+, К+- АТшазы, вплоть до полного исчезновения ее активности как в максимально "светлых", так и максимально "темных" клетках.
Массивная трансфузия несовместимой крови очень быстро /в течение мин/ обуславливает в клетках нефрона и собирательной почечной трубочки резкое уменьшение количества "промежуточных" клеток за счет увеличения количества, главным образом, "темных" клеток. Одновременно почти во всех клетках происходит массовое разрыхление внутренних мембран и появление в цитоплазме преципитатов и коагулятов. В "светлых" и "темных" клетках животных этой серии опытов так же, как и у интактных крыс, активность фермента была очень низкой или совсем не выявлялась. Активность На+, к+-АТФазы "промежуточных" клеток отличалась хаотичностью и выраженной гетерогенностью: в большинстве клеток ее активность резко снижалась, в отдельных оставалась нормальной и лишь изредка несколько превышала нормальные величины. Вышеописанные изменения в последующие минуты и часы нарастали, однако в общем пуле клеток имело место появление значительного числа клеток, обладающих электронносветлой протоплазмой.
Состояние ультраструктуры различных клеток нефрона, а также локализация активности ихНа+, К*- АТФазы после внутривен-
ного введения животным гепарина в средних дозах заметно не изменялись. Отмечено только некоторое увеличение количества "светлых" клеток, со снижением активности их Na+, К+- АТШазы.
Гепарин, введенный внутривенно перед воспроизведением ГДТ, предотвращает повреждение ультраструктуры различных клеток неф-рона и снижение активности Na+, К+-АТФазы.
На защиту выносятся следующие основные положения;
В различных клетках нефрона и собирательной почечной трубочки активность Na+, К+-АТФаза выявляется в их плазмолемме, наружной ядерной мембране и фибриллярных структурах ядрышка.
АктивностьNa+, К-АТФазы различных клеток нефрона и собирательной почечной трубочки находится в зависимости от их электронной плотности: максимальной активностью фермента обладают так называемые "промежуточные" клетки, по мере же увеличения электронной плотности клеток или наоборот, уменьшения их электронной плотности происходит уменьшение активности Na+, К+-АТФазы, вплоть до полного исчезновения ее активности как в максимально "светлых", так и максимально "темных" клетках.
В условиях генерализованного декомпенсированного тром-биногенеза, вызванного массивной трансфузией несовместимой /гетерогенной/ крови, происходит повреждение клеток нефрона и собирательной почечной трубочки обычно на фоне заметного повышения их электронной плотности. Это сопровождается резким снижением активности ихжа+, К+- АТШазы.
Гепарин, введенный внутривенно интактным животным, обуславливает снижение электронной плотности ряда клеток проксимальной части канальца нефрона, что ведет за собой снижение актив-
- ІЗ -
ности ихНа+, К+-АТазы.
5. Гепарин, введенный перед воспроизведением генерализованного декомпенсированного тромбиногенеза, способен предотвратить повреждение клеток нефрона и собирательной почечной трубочки, Одновременно он предотвращает повышение электронной плотности данных клеток и снижение активности ихиа+, Е^-АТШазы.
