Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Аллельный полиморфизм идентификационных молекулярно-генетических локусов человека (аналитический обзор литературы)
1.1. Проблемы идентификации в судебно-медицинской практике 11
1.2. Антропологические аспекты молекулярно-генетического типирования локусов генома человека 13
1.3. Вариабельность структуры ДНК как источник полиморфизма живых организмов 16
1.4. Полиморфизм идентификационных локусов генома человека и моле кулярно-генетические методы его исследования 21
1.5. Статистические основы вероятностного характера идентификационного молекулярно-генетического анализа 27
1.6. Применение тест-набора «Ampli TypePM+DQAl PCR Amplification andTyping Kit» (Perkin-Elmer,U.S.A.) в судебно-медицинских целях 31
1.7. Популяционные исследования идентификационных локусов человека в различных группах населения 35
Глава II. Материалы и методы исследования 39
Глава III. Распределение частот аллелей и генотипов локусов HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC в Тюменской области 52
3.1. Анализ полиморфизма локусаНЬA DQА1 52
3.2. Анализ полиморфизма локусов LDLR, GYP A, HBGG, D7S8, GC
Глава IV. Сравнительный анализ характера распределения частот встречаемости аллелей локусов HLADQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC У населения тюменской области и других регионов мира 69
Обсуждение результатов исследования 104
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список литературы
- Антропологические аспекты молекулярно-генетического типирования локусов генома человека
- Применение тест-набора «Ampli TypePM+DQAl PCR Amplification andTyping Kit» (Perkin-Elmer,U.S.A.) в судебно-медицинских целях
- Анализ полиморфизма локусов LDLR, GYP A, HBGG, D7S8, GC
- Обсуждение результатов исследования
Введение к работе
Актуальность исследования. Одним из важных направлений деятельности судебно-медицинской службы в раскрытии наиболее тяжких преступлений против жизни и здоровья граждан является идентификация личности (Кинле А.Ф., 1997; Пашинян ГА, Тучик Е.С., 1997; Заславский Г.И., Попов В.Л., Владимиров Ю.В., 2000). Определенные успехи, достигнутые в этой области, во многом обусловлены неразрывной связью судебно-медицинской науки с экспертной практикой (Исаков В.Д., Дыскин ЕА., 1996; Солохин АА., Тхакаков АА., 1996; Томилин В.В., Гедыгушев ИА., Назаров Г.Н., 1996). Разработанные за последние годы новые методы исследования расширили диагностические возможности, повысили научную обоснованность и доказательное значение экспертных заключений (Чернышев А.П., Авдеев А.И., Леонов СВ., 1996; Абрамов С.С, Болдырев Н.И., Вишняков Г.Н., 1998; Сидоров В.Л., Заславский Г.И., Попов В.Л., 2003).
Одним из таких методов является молекулярно-генетический анализ, который позволяет проводить убедительную судебно-медицинскую идентификацию при исследовании вещественных доказательств в случае нанесения тяжких телесных повреждений, убийств, изнасилований (Иванов П.Л., Орехов В.А., Янковский Н.К., 2001). Геномная «дактилоскопия» незаменима также при установлении кровного родства в экспертизах спорного отцовства, детоубийства, подмены или хищения детей, при эксгумациях неопознанных гнилостно-измененных трупов, массовых катастрофах, террористических актах, когда идентификация личности не может быть проведена другими методами (Иванов П.Л., Вербовая Л.В., Гуртовая СВ., 1991; Новоселов В.П., Шаронова ДА., 1999).
В этих целях широко используются технологии генной инженерии, основанные на исследовании отдельных участков геномной ДНК человека, которые строго специфичны для каждого индивидуума (Jeffreys A.J., Brookfleld J.F.Y., Semenoff R., 1985; Иванов П.Л., 1996). Ведущее место занимают методы, основанные на энзиматической амплификации в полимеразной цепной реакции гипервариабельных мультиаллельных генетических локусов (Mullis К.В., Fa-loona F., 1987; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., 1988). При этом в роли индивидуализирующих личность признаков выступают конкретные варианты (аллели) исследуемых (типируемых) локусов, свойственные данному человеку - своего рода маркеры индивидуальности.
На современном этапе развития судебная молекулярно-генетическая экспертиза носит вероятностный характер, который зависит от распространенности выявленного геномного профиля в популяции (Rolf В., Horst В., Eigel А., 1998; Rosenberg N.A., Pritchard J.K., Weber J.L., 2002). Результаты сравнительного анализа генетической вариабельности идентификационных локусов у неродственных индивидуумов, проживающих на различных территориях, свидетельствуют о достоверных различиях даже у представителей одной националь-
ности (Lowe A.L., UrquhartA., Foreman LA., 2001; TofaneUi S., Boschi L, Berton-eri S., 2001). Поэтому использование отечественными судебно-медицинскими молекулярно-генетическими лабораториями в своей работе данных для населения других стран является некорректным и при определенных условиях снижает доказательственное значение результатов проведенного исследования.
В связи с этим для повышения качества судебно-медицинских молеку-лярно-генетических экспертиз возникает необходимость исследования полиморфизма идентификационных локусов генома человека на территории Западной Сибири с целью выявления региональных особенностей распределения ал-лельных частот.
Цель исследования. Для повышения достоверности судебно-медицинской идентификации личности и установления кровного родства выявить отличия молекулярно-генетической конституции жителей региона Западной Сибири на примере Тюменской области в сравнении с другими группами населения России и зарубежных стран.
Задачи исследования:
-
Изучить с помощью лицензированной для судебно-медицинских исследований тест-системы («Ampli Type PM+HLA DQ Al Amplification and Typing Kit», Perkin-Elmer, U.SA.) полиморфизм последовательностей геномной ДНК идентификационных локусов человека - HLA DQ AI, LDLR, GYP А, HBGG, D7S8, GC - у «коренного» русского населения региона Западной Сибири, а также их сочетаний (генотипов) в исследованной выборке.
-
Выявить особенности распределения частот встречаемости аллелей и генотипов тестируемых локусов, используемых для целей судебно-медицинской идентификации, у «коренного» русского населения региона Западной Сибири и их отличия от аналогичных данных для населения других регионов России и зарубежных стран.
3. Определить возможность использования (с помощью тестов на сцеп
ление и равновесие Харди-Вайнберга) установленных статистических частот
аллелей локусов HLA DQ AI, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC у «коренного»
русского населения территории Западной Сибири в вероятностных расчетах
при проведении судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз
идентификации личности и установления кровного родства
Научная новизна исследования. Выявлены достоверные отличия в частотах аллелей и их сочетаний (генотипов) анализируемых локусов у «коренного» русского населения региона Западной Сибири по сравнению с населением других территорий России (Центрального и Северо-Западного регионов, Урала, коренных жителей Ямало-Ненецкого автономного округа) и ряда зарубежных стран (США, Японии, Италии, Рермании, Польши, Хорватии, Пакистана, Финляндии).
На основании проведенного теста на сцепление локусов HLA DQ AI, LDLR, HBGG, GYPA и GC и теста на равновесие Харди-Вайнберга у населе-
ния Западной Сибири показано независимое наследование аллелей анализируемых локусов и соответствие наблюдаемых частот встречаемости генотипов теоретически ожидаемым.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В группе «коренного» русского населения Западной Сибири с определенной частотой выявлены все возможные варианты аллелей идентификационных локусов человека HLA DQ AI, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC, широко используемых в судебно-медицинской практике и типируемых тест-системой «Ampli Type PM+HLA DQ Al Amplification and Typing Kit».
-
Характер распределения частот аллелей и генотипов идентификационных локусов HLADQ AI, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC в исследуемой выборке свидетельствует о существенных различиях с населением других регионов России и некоторых зарубежных стран.
-
Нахождение популяции «коренного» русского населения региона Западной Сибири в равновесии Харди-Вайнберга позволяет использовать полученные данные по частотам встречаемости аллельных вариантов для стандартных вероятностных расчетов при проведении судебно-медицинских молекулярно-генетических исследований.
Практическая значимость работы. Характер распределения статистических частот аллелей локусов HLADQ AI, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC отличается у «коренного» русского населения региона Западной Сибири в сравнении с аналогичными данными для жителей других территорий. Независимое наследование аллелей тестируемых локусов и соответствие популяции жителей региона Западной Сибири равновесию Харди-Вайнберга позволяет использовать их в качестве опорных параметров для вероятностных расчетов при проведении судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз. Использование выявленных региональных частот аллелей локусов HLA DQ AI, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC у населения Западной Сибири повышает доказательное значение судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз при идентификации личности и при установлении кровного родства.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу судебно-медицинских экспертов молекулярно-генетических лабораторий Тюменского, Челябинского, Самарского и Ленинградского областных бюро судебно-медицинской экспертизы, а также используются в учебном процессе на кафедре судебной медицины Тюменской государственной медицинской академии и кафедре криминалистики и судебной медицины Тюменского юридического института.
Апробация материалов работы. Основные положения были доложены на международных симпозиумах «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1988, 1999, 2001); Пироговской межвузовской научной конференции студентов
и молодых ученых (Москва, 2000); на V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000); на V Юбилейной научно-практической конференции Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2001); на научно-практической конференции «Актуальные теоретические и практические аспекты восстановления и сохранения здоровья человека» (Тюмень, 1998, 2003); на юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебной и клинической медицины» (Ханты-Мансийск, 2002).
В 2002 году по теме исследования «Региональные особенности генетической конституции человека, используемые для идентификации личности, как показатель избирательного накопления генетических признаков на территории Тюменской области» был получен грант Губернатора Тюменской области по итогам регионального конкурса научно-исследовательских проектов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 376 источников (195 отечественных и 181 иностранных), а также приложения. Объем диссертационной работы составляет 164 страницы машинописного текста, она содержит 38 таблиц и 19 рисунков.
Антропологические аспекты молекулярно-генетического типирования локусов генома человека
Полиморфизм большинства используемых в судебной медицине мо-лекулярно-генетических локусов изучается не только для выявления их идентификационного значения, но и для иных прикладных целей. Например, для ассоциативных поисков по наследственным заболеваниям (Ghabanbasani М. Z., Buyse I., Legius Е., 1994; Zamani M.G., De Hert M., Spaepen M., 1994; Char-ron D., 1997), при мониторинге приживления трансплантатов (Алексеев А.П., 1999; Алексеев Л.П., Хаитов P.M., 1999), в том числе и по пересадке костного- мозга (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996; Соколов Е.И., Глан П.В., Гришина Т.Н., 1998; Новиков Д.К., 1999; Caenazzo L., Ponzano Е., Fenato F.A., 2000), при аутоиммунных заболеваниях и развитии опухолей (Зарецкая Ю.М., 1999; Бубнова Л.Н., Глазанова Т.В., Лысова Л.В., 1999; Buyse I., Decorte R., Baens M., 1993), невынашивании беременности (Болдырева М.Н., Хаитов P.M., Барцева О.Б., 2004).
В ряде научных работ есть указания не только на ассоциацию набора аллельных вариантов локусов генома человека с различными заболеваниями (Акопян А.В., Алексеев Л.П., Хаитов P.M., 1998; Руднева Л.Ф., Андросова Л.А., 2000; Zamani M.G., De Hert М., Spaepen М., 1994), но и с реакцией индивида на такие неблагоприятные факторы внешней среды, как повышенный радиационный фон, проживание в регионах с экстремальными климато-географическими условиями, профессиональным контактом с вредными производственными факторами (Коненков В.И., 1999).
Полиморфизм локусов генома человека широко используется также в сравнительно-антропологических исследованиях (Bodmer J., Bodmer W., 1970; Lopes-Larrea С, 2001; Scholz M., Hengst S., Broghammer M., 2001; Osier M.V., Cheung K.H., Kidd J.R., 2002). В современной антропологии как области научного познания, в рамках которой изучаются фундаментальные проблемы существования человека в природной и искусственной среде, встречаются различные варианты систематизации антропологических дисциплин (археология, этнография, этнология, фольклор, лингвистика, физическая и социальная антропология, медицинская антропология, экология человека и др.). Дальнейшее их развитие связано с более широким использованием данных по генетике индивидуального развития и популяционной генетике, экологии человека, акценты на эволюционный анализ происхождения человека, процессов расообразования, изменения биохимической и физиологической организации, прежде всего иммунитета посредством создания устойчивого полиморфизма (Мещеряков Б.Г., Мещерякова И.А., 1994; Орлова Э.А., 1994; ФефеловаВ.В., 2001).
Соматотипирование человека с использованием методов биологической антропологии (антропоскопия, антропометрия, краниология, остеология, дерматоглифика, исследование крови и т.д.) прочно вошло в практику антропологов (Акимова М.С., 1974; Цецкладзе О. И., 1999). Изучение основных соматических типов и типов телосложения в различных группах населения: мужчин различных возрастов (Ефремова В.П., Шаранкина Е.П., Дегтярева Т.Г., 2001; Синдеева Л.В., 2001; Щедрин А.С., Малиновская Е.В., Демарчук Е.Л., 2001), женщин (Логачева Г.С., Щедрина А.Г., 2001; Макаренко Т.А., Цхай В.Б., Николаев В.Г., 2001; Нор-Аревян К.А., 2001), детей (Кой-носов П.Г., Чирятьева Т.В., Койносов А.П., 2001; Прокопьев Н.Я., Койно-сов П.Г., Ананьев В.Н., 2001; Щедрин А.С., Поляков А.Я., Петруничева К.П., 2001; Яйленко А.А., Зернова Н.И., 2001; Соколов А.Г., 2002) и подростков (Литовченко О.Г., Михеева М.А., Нифонтова О.Л., 2001) перекликаются с дерматоглифическими исследованиями (Борецкий В.М., 1985; Полина Н.И., 1988; Кривич И.П., Багацкая Н.В., Мазур Н.И., 1990; Филиппов В.И., 1990; Божук Т.Н., Крикун Е.Н., 2001). Большое внимание уделяется как установлению связи соматотипа (дактилотипа) с различного рода заболеваниями, та 15 кими как эпилепсия (Харитонов Р.А., Козлова А.И., 1985), шизофрения (Сорокина Т.Т., Гусева И.С., 1991), заболевания позвоночника (Веренич СВ., ВереничВ.В., 1991), профзаболевания (Кочнева М.Ю., ПолзикЕ.В., Кац-нельсон Б.А., 1988), легочная патология (Чистикин А.Н., Кудряшов В.П., Чистикина Т.А., 1991; Чистикин А.Н., 1993), нейромышечная дистрофия (Во-rissova P., Tournev L, Tornjova S., 2001), а также с профессиональной направленностью (Никитюк Б.А., Чистикин А.Н., 1996; Вериго Л.И., Волын Т.П., 2001; Жвавый Н.Ф., Орлов С.А., Визгалов О.В., 2004), прогнозом спортивной перспективности (Шварц В.Б., Алексеева СВ., 1988; Белобородова Е.А., Ма-зонко Э.А., 1991; Чистикин А.Н., Чистикина Т.А., 1996; Бузмаков В.А., 2004; Strudwick A., Reilly Т., Doran D., 2002), так и исследованиям по антропогене-тике (НикитюкБ.А., 1988; КондикВ.М., 1989; БалановскаяЕ.В., Балановский О.П., Нурбаев С.Д., 2000) и этнической антропологии (Гладкова Т.Д., Пу-рунджан А.Л., Хомякова М.А., 1987; Лазарев К.Ю., Голубцов В.И., 1990; Хить Г.Л., 1991; Чистикин А.Н., 1997; Чистикин А.Н., Чистикина Т.А., 2001). В последнее время наряду с работами по морфологической антропологии (Макарова Л.Н., Лотош Е.А., 1991; Пашинян Г.А., Мурзова Т.В., Гажва СИ., 2002; Dimaggio F., Dellavia С, Ferrario V., 2002; Kroonenburgh М., Schoon Е., Кар Р., 2002) и физиологической антропологии (Ксендзов Л.И., Горин B.C., Калимулина Т.К., 2000; Койносов П.Г., Койносов А.П., Прокопьева В.А., 2001; Жвавый Н.Ф., Орлов С.А., Визгалов О.В., 2003; Angelov G., 2000) появляется много работ по антропогенетике, основанных на исследовании генома человека с использованием методов генной инженерии, в том числе и генов HLA класса II (Хидиятова И.М., Хуснутдинова Э.К., 2000; Белоусова Р.А., Фефелова В.В., 2001; Seesod N., Allen М, Sueblinvong Т., 2000). В частности, для такого рода исследований широко используют методы рестрикционного анализа ДНК (Казаковцева М.А., 2000; Осипова Л.П., Вибе В.П., Лефранк Ж., 2000), секвенирования (Голубенко М.В., Пузырев В.П., Салюков В.Б., 2000; Relethford J., 2001) и полимеразной цепной реакции (Бермишева М.А., Викторова Т.В., Евграфов О.В., 2000; Hamdy S., Hiratsuka М., Narahara К., 2002).
Таким образом, применение достижений молекулярной генетики позволяет более полно представить индивидуальные характеристики человека с антропологической точки зрения и выявить их значение в целях идентификации личности при решении судебно-медицинских задач.
Применение тест-набора «Ampli TypePM+DQAl PCR Amplification andTyping Kit» (Perkin-Elmer,U.S.A.) в судебно-медицинских целях
Геномная ДНК из жидкой крови и пятен крови на марле выделялась по методике, описанной в инструкции к «Ampli TypePM+DQAl PCR Amplification and Typing Kit» (AmpliType User Guide Version 2, Perkin-Elmer Corporation, 1993). Кроме того, использовались общепринятые методики выделения ДНК. Кроме фенол-хлороформной экстракции ДНК выделяли с помощью ряда коммерческих наборов, основанных на применении сорбентов -хелатирующих полимеров - «Эксперт-1» (г. Санкт-Петербург), «DIAtom DNA Prep 200» (г. Москва) - в точном соответствии с прилагаемой фирмой-производителем инструкцией. Для некоторых образцов проводили дополнительную очистку и концентрирование ДНК с использованием колонок для ультрафильтрации «Сепricon - 100» производства фирмы «Amicon» (США).
Концентрацию ДНК в образцах определяли электрофоретически (сравнивая с известными разведениями ДНК фага X) либо спектрофотомет-рически. Остановимся подробнее на указанных методах исследования.
При выделении ДНК методом экстракции органическими реагентами кровь из вены в количестве 6,0 мл отбирали в пробирки с добавлением антикоагулянта (соотношение антикоагулянта и крови 1:6). В качестве антикоагулянта использовали следующий раствор: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% трехзамещенного цитрата натрия и 1,47% глюкозы. В пробирку добавляли три объема охлажденного буфера А (10 мМ трис-HCl рН=7,5; 10 мМ NaCl) и осторожно перемешивали. Центрифугировали 5 минут при 5000 об/мин. Осадок дважды промывали буфером А. После последней промывки осадок ре-суспендировали в буфере А, добавляли додецилсульфат натрия (SDS) до 0,5%, прогревали 30 минут при 65 С, добавляли протеиназу К до 300 мкг/мл и инкубировали в термостате при 37С в течение 18 часов. По окончании инкубации добавляли 5 М раствор хлорида натрия до 1 М. Из полученного раствора белки удаляли последовательной экстракцией смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом. ДНК из водной фазы осаждали, добавляя два объема охлажденного (до -20С) этанола. Осадок собирали центрифугированием и промывали его 70% этиловым спиртом. Полученный осадок подсушивали в суховоздушном термостате при 50С до исчезновения капель этанола на стенках пробирки и растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис-НСІ рН=8,0; 1 мМ EDTA). Полученный раствор ДНК хранили при 4 С.
При выделении ДНК из пятен крови с использованием органических реагентов, около 1см образца крови (на марле) вырезали и помещали в пластиковую пробирку типа "Eppendorf, добавляли 0,5 мл буфера А (ЮмМ трис-HCl, рН=7,5; ЮмМ NaCl) и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляли 25 мкл 20% SDS и прогревали при 65С в течение 30 минут. Затем добавляли 20 мкл протеиназы К (в концентрации 10 мг/мл) и оставляли на 18 часов при температуре 37 С. По окончании инкубации добавляли 150 мкл 5М NaCl и проводили последовательную экстракцию смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом с последующим осаждением ДНК охлажденным (-20С) этанолом в течение 24 часов. Осажденную ДНК центрифугировали, надосадочную жидкость сливали, осадок подсушивали в термостате при 56С до исчезновения капель этанола на стенках пробирки и растворяли в буфере ТЕ (ЮмМ трис-НС1, рН=8,0; 1мМ ЭДТА), прогревая 30 минут при 65С и 18 часов при 37С. Полученный раствор ДНК хранили при 4С.
Выделение нативной ДНК методом нуклеосорбции проводили с использованием наборов «Эксперт-1» и «DIAtom DNA Prep 200». Набор-«DIAtom DNA Prep 200» основан на применении гуанидинизотиоционата, который является очень сильным денатурирующим агентом и используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков. В основе метода лежит лизис ядерных белых клеток крови и сорбция молекул ДНК на сорбенте Si02.
При выделении ДНК из жидкой крови ее отбирали в пробирки с добавлением антикоагулянта. Из каждой пробы брали по 200 мкл цельной крови, помещали в 1,5 мл пробирки типа "Eppendorf . Выделение ДНК проводили с использованием набора «DIAtom DNA Prep 200», который основан на использовании «Лизирующего реагента» с гуанидинтиоцинатом и активной сорбции ДНК на сорбенте «NucleoS» с последующей ее элюцией из сорбента «ЭкстраГеном».
При работе с пятнами крови из образцов на марле делали вырезки около 1,0 см , помещали в 1,5 мл пробирки типа "Eppendorf, добавляли 500 мкл стерильной дистиллированной воды. Инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. По окончании инкубации пробирки центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин, надосадочную жидкость, кроме последних 20 мкл, удаляли. Фрагмент материала также оставляли в пробирке. Выделение ДНК из этого осадка проводили с использованием набора «DIAom. DNA Prep 200», основанном на использовании «Лизирующего реагента» с гуанидинтиоцинатом и активной сорбции ДНК на сорбенте «NucleoS» с последующей ее элюцией из сорбента «ЭкстраГеном». ДНК хранили при 4 С.
Набор реагентов «Эксперт-1» и технология его применения специально разработаны для получения готовых к амплификации концентрированных препаратов геномной ДНК из разных типов клеток человека, содержащихся в следах крови, слюны, спермы, единичных корневых частях волос, фрагментов мышечной ткани и жидкой крови.
Действие набора основано на щелочном лизисе клеток, адсорбции ДНК на специально приготовленном материале («биоматрикс») в условиях высокой ионной силы раствора и элюции в малом объеме готовой к ПНР амплификации геномной ДНК. Специалистами фирмы «ХЕЛИКС» на базе бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Ленинградской области проведены серийные испытания набора с применением распространенных в судебно-медицинской практике генетических систем типирования, включая локус HLADQA1.
При экстрагировании ДНК с использованием набора «Эксперт-1» фрагмент материала со следами крови размером не более 1,0x1,0 см, либо 3-20 мкл жидкой крови помещали в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, добавляли 500 мкл стерильной дистиллированной воды и оставляли при комнатной температуре на 15-30 минут. По истечении указанного времени пробу центрифугировали 3 минуты при 10 000 об/мин, супернатант удаляли, оставляя примерно 10 мкл с осадком. Если ДНК выделяли из пятна крови, фрагмент материала также оставляли в пробирке вместе с осадком. В пробирку добавляли 100 мкл «лизисного буфера» и инкубировали пробу при 65С в течение 10 минут. По окончании инкубации добавляли 20 мкл «нейтрализи-рующего буфера», аккуратно перемешивали содержимое пробирки и по мешали пробирку на ледяную баню на 10 минут. Добавляли 220 мкл «связывающего буфера» и перемешивали. Максимально отбирали раствор без фрагмента материала в новую стерильную микропробирку. Добавляли 5 мкл предварительно хорошо перемешанного «биоматрикса». Оставляли пробу на 25 минут при комнатной температуре, встряхивая пробирку каждые 5 минут. Центрифугировали пробирку 5 секунд при 10 000 об/мин. Жидкую фазу удаляли из пробирки, а осадок промывали, добавляя 300 мкл «отмывочного буфера», и центрифугировали 5 секунд при 10000 об/мин. Жидкую фазу тщательно отбирали и удаляли из пробирки. Этапы промывки повторяли 1-2 раза, остатки жидкой фазы удаляли с помощью стерильной полоски фильтровальной бумаги. К осадку добавляли 20 мкл «элюирующего буфера», тщательно перемешивали и инкубировали пробу при 65С в течении 25 минут, встряхивая пробирку каждые 5 минут. Центрифугировали пробу 30 секунд при 10000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость, стараясь не захватить «биоматрикс». Готовый раствор ДНК хранили при 4С. При:постановке. ПЦР в амплификационную смесь во избежание ингибирования амплификации добавляли компонент «амп-плюс».
Анализ полиморфизма локусов LDLR, GYP A, HBGG, D7S8, GC
В настоящее время при проведении вероятностных расчетов при проведении судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных экспертиз и установления кровного родства используются частотные характеристики аллелей локусов генома человека, установленные в результате обследования населения различных расовых групп, без учета климато-географических условий проживания. Так, для локусов HLA DQ Al, LDLR, GYP A, HBGG, D7S8 и GC, применяемых в судебно-медицинских целях на территории России, рекомендуются частоты встречаемости аллелей для европеоидного населения США (AmpliType User Guide Version 2, Perkin-Elmer Corporation, 1993).
Однако использование этих данных в качестве стандартных на других популяциях некорректно, потому что их подразделенность на различных территориях изучалась крайне мало. В связи с этим для выявления региональных особенностей в нашем исследовании было проведено сравнение аллель-ных частот анализируемых локусов «коренного» русского населения Тюменской области с аналогичными данными для других регионов мира.
Выявленные в настоящей работе частоты встречаемости аллелей ло-куса HLA DQ А1 сопоставляли с аллельными частотами шестнадцати популяций, проживающих как на территории России (среднестатистическими показателями для Российской Федерации, Уралом, Северо-Западным регионом России, Центральной части России, в которую вошли г. Москва и Республика Беларусь, коренным населением ЯНАО), так и за ее пределами (Австралией, США, Японией, Германией, Италией, Хорватией, Пакистаном, Финляндией). Результаты генотипирования ДНК указанных групп населения были получе 70 ны в ходе проведения исследований вещественных доказательств с целью идентификации личности или установления кровного родства, либо в результате антропологических исследований (ненцы ЯНАО).
Сравнительный анализ полиморфизма проводился не только с европеоидным населением США, но и с испаноязычным населением и афроаме-риканцами, а также японцами. Выбранные популяции сравнивались как с репрезентативной выборкой «коренного» русского населения Тюменской области, так и между собой.
В настоящем исследовании репрезентативная выборка Тюменской области отличалась по характеру распределения частот аллелей локуса HLA DQ А1 от населения Центральной части России, в которое вошло население г. Москва и Белоруссии, а также ненцами Ямало-Ненецкого автономного округа (р 0,05). С другими регионами России статистически значимых отличий не выявлено (табл. 16).
Выраженные отличия в частотах встречаемости аллели HLA DQ А1 «1.1» наблюдались у населения Тюменской области с коренным населением ЯНАО (ненцами), с населением же Центральной части России (г. Москва и Белоруссии) эти различия были незначительны.
Аллель «2» локуса HLA DQ А1 встречалась в Тюменской области несколько чаще, чем у ненцев и населения Центральной части России, а аллель HLA DQ А1 «3» - реже. Причем в отношении аллели «3» наибольшие отличия у «коренного» русского населения Тюменской области наблюдались с ненцами. Аллель же «4» у всех этих четырех групп населения практически не отличалась между собой.
Несмотря на наличие статистически значимых отличий в характере распределения аллелей локуса HLA DQ А1 при сравнении с коренным населением ЯНАО - ненцами, у «коренного» русского населения наблюдалась тенденция к сближению частот встречаемости аллели HLA DQ А1 «1.3». Это же касается и населения Урала. Характеристики частот аллели HLA DQ А1 «1.3» для ряда регионов России представлены на рис. 8.
Частоты встречаемости аллелей локуса HLA DQ А1 населения Тюменской области и США В инструкции к набору «Ampli Type PM+HLA DQ Al Amplification and Typing Kit» (Perkin-Elmer,U.S.A.) аллельные частоты, выявленные при обследовании указанных групп населения, предложены в качестве стандартных для интерпретации молекулярно-генетических экспертиз при идентификации личности и установлении кровного родства.
Население Тюменской области и европеоиды США имели значительные отличия только в частоте встречаемости аллели HLA DQ А1 «3». Частота же аллели «1.3» и «4» у этих групп населения практически совпадала. Поэтому если в расчетах при проведении молекулярно-генетических экспертиз на территории Тюменской области будут задействованы аллели HLA DQ А1 «1.3» и «4», то погрешности при использовании аллельных частот, вычисленных при обследовании европеоидного населения США, не будет. Однако в случае наблюдения аллели «3» локуса HLA DQ А1 инкриминирующая вероятность (в случае гомозиготности) для русского населения Тюменской области будет 81,2%, а для европеоидов США - всего 73,0%. испаноязычное население США Из представленных в табл. 17 показателей следует, что жители Тюменской области имели выраженные отличия от населения США, Пакистана и Японии и не имели отличий с населением Австралии (р 0,05). При этом население США, Японии и Пакистана различалось в характере распределения частот аллелей локуса HLA DQ А1 не только с русскими Тюменской области, но и друг с другом.
Аллельный полиморфизм локуса HLA DQ А1 на территории Тюменской области сравнивали и с рядом европейских популяций - Германией, Италией, Хорватией и Финляндией. Показатели точного теста для этих групп населения представлены в табл. 18.
Обсуждение результатов исследования
Проведенный нами анализ полиморфизма анализируемых локусов в референтной выборке «коренных» русских, проживающих на территории Тюменской области выявил наличие аллелей, встречающихся с определенной частотой в обследованной группе населения.
Для пяти локусов, тестируемых системой «PolyMarker» и локуса HLA DQ А1 проводился тест на сцепление с использованием ЕМ-алгоритма. Заданное количество перестановок соответствовало 100000. При проверке возможного сцепления пар локусов между собой статистически значимых отличий не получено. Следовательно, сцепления во всех исследуемых локу-сах не выявлено.
Полученные результаты исследования полиморфизма локусов, тестируемых системой «PolyMarker» и HLA DQ А1 в Тюменской области впервые подвергали сравнению с аналогичными данными различных регионов России и зарубежных стран. Причем сравнение проводилось не только между населением Тюменской области и другими регионами, но и между всеми остальными популяциями между собой. В результате этого был выявлен ряд отличий, на которых следует остановиться подробней.
Статистически значимые отличия в частотах встречаемости аллелей локуса HLA DQ А1 (р 0,05) были получены при сравнении русского населения Тюменской области с населением США (европеоидным и испаноязыч-ным населением, афроамериканцами), Японии, Италии, Хорватии, Пакистана, Финляндии, а также с населением центральной части России (в которое вошло население Республики Беларусь и г. Москва) и коренным населением Ямало-Ненецкого автономного округа - ненцами.
Так, по нашим данным частота аллели «1.1» локуса HLA DQ А1 составила 0,1617, тогда как частота встречаемости этой аллели у европеоидного населения США - 0,1342; у испаноязычного населения США - 0,1270
Частота встречаемости аллели «1.2» локуса HLA DQ А1 у «коренного» русского населения Тюменской области по результатам нашего исследования составила 0,2244; тогда как частота встречаемости этой аллели у европеоидного населения США - 0,2056; у испаноязычного населения США -0,1443; у афроамериканцев - 0,2844; у населения Японии - 0,1550; Италии — 0,1833; Хорватии - 0,2670; Пакистана - 0,1280; Финляндии - 0,2010; населения Республики Беларусь - 0,0790; у населения г. Москва - 0,0710; у ненцев -0,0761.
Наименьшие статистически значимые отличия в частоте встречаемости этой аллели в Тюменской области наблюдались при сравнении с европеоидным населением США, населением Финляндии и Хорватии, наибольшие - при сравнении с населением центральной части России и ненцами ЯНАО. Однако эти весьма значительные отличия, возможно, обусловлены погрешностью вследствие малой выборки для этих групп населения (для
107 г. Москва п=120, для Республики Беларусь п=70, для ненцев ЯНАО п=92). Для сравнения, количество обследованных европеоидных индивидуумов США составляла 3094. Эта погрешность может наблюдаться и при анализе частот встречаемости других аллелей локуса HLA DQ А1.
По мнению ряда авторов, высокий уровень полиморфизма большинства молекулярно-генетических локусов требует исследования по каждому из них не менее 200 неродственных человек и/или 500 мейозов для создания адекватной референтной популяционной базы данных (Balding D.J., Nichols R.A., 1994; Weir В. S., 1996). Однако отмечено, что и такой объем недостаточен для достоверного тестирования выборок на РХВ. При формировании эталонной популяционной базы данных по частотам аллелей объем исследуемой выборки в 200 человек в настоящее время является стандартом скорее в силу традиции, чем по другим, более объективным причинам (Buckleton J.S., Walsh S., Harbison S.A., 2001). В нашем исследовании по локусу HLA DQ А1 протипировано 303 человека, а по локусам LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC -264 человек.
Для корректного использования "правила перемножения частот" необходимо учитывать возможные не выявленные отклонения от равновесия. Эти отклонения могут быть обусловлены различными причинами, и в первую очередь неизвестной в каждом конкретном случае подразделенностью популяции. Соответственно, при вероятностных расчетах в экспертной практике ожидаемые частоты генотипов рекомендовано определять из «эталонных» частот аллелей с обязательным использованием специальных корректирующих коэффициентов (National Research Council of the USA, 1996). Однако реальная оценка таких коэффициентов в различных популяциях и для различных локусов является отдельной и достаточно сложной задачей (Evett I.W., Weir B.S., 1998).
Что же касается аллели «1.3», то ее частота в нашем исследовании составляла 0,0693; у европеоидного населения США - 0,0652; у испаноязычно-го населения США - 0,0485; у афроамериканцев - 0,0418; у населения Япо 108 ний - 0,2078; Италии - 0,0609; Хорватии - 0,0762; Пакистана - 0,1620; Финляндии - 0,0670; Республики Беларусь — 0,1640; у населения г.Москва — 0,2290; у ненцев - 0,0870. Из приведенных данных следует, что наименьшие статистически значимые отличия обнаружены при сравнении населения Тюменской области с населением Финляндии, Италии, Хорватии, а также с европеоидами США, а наибольшие — при сравнении с населением Центральной части России и населением Японии и Пакистана.
Выявленная в нашем исследовании частота аллели «2» составила 0,1502; тогда как частота встречаемости этой аллели у европеоидного населения США - 0,1334; у испаноязычных США - 0,1053; у афроамериканцев -0,1102; у населения Японии - 0,0041; Италии - 0,1354; Хорватии - 0,0919; Пакистана - 0,0980; Финляндии - 0,0580; Республики Беларусь - 0,1070; у населения г.Москва - 0,1040; у ненцев - 0,1087. Частота встречаемости аллели «2» локуса HLA DQ А1 в исследованной выборке имела наибольшие отличия с населением Японии, Финляндии, Хорватии и Пакистана.
Частота встречаемости аллели «3» локуса HLA DQ А1, полученная при обследовании русских Тюменской области, была равна 0,1155. По литературным данным у европеоидного населения США она равна 0,1847; у испаноязычных США - 0,2211; у афроамериканцев - 0,1063 (Tahir М.А., Hamby P.P., Asghar А., 1994); у населения Японии - 0,3968 (Watanabe Y., Yamada S., Nagai A., 1997); Италии - 0,0737 (Spinella A., Marsala P., Biondo R., 1997); Хорватии - 0,1050 (Keys K.M., Budowle В., Andelinovic S., 1996); Пакистана-0,0730 (Tahir M. A., Caruso J., Budowle В., 1997); Финляндии - 0,1740 (Sajanila A., Strom M., Budowle В., 1991); Республики Беларусь - 0,2070; у населения г. Москва - 0,1920 (Ovchinnikov I .V., Chistyakov D.A., Nosikov V.V., 1995); у ненцев - 0,3424 (Алексеев Л.П., Гуськова И.А., Болдырева М.Н., 1994). Статистически значимые отличия наблюдались при сравнении русских жителей Тюменской области с афроамериканцами, жителями Хорватии, Италии и Пакистана, а также при сравнении с ненцами ЯНАО.
![Комплексное исследование анатомо-морфологических особенностей строения ушной раковины и зубных рядов для идентификации личности [Электронный ресурс]](/i/i/4351/195687.png "Комплексное исследование анатомо-морфологических особенностей строения ушной раковины и зубных рядов для идентификации личности [Электронный ресурс] Малахов Даниил Валерьевич")
![Возможности ладонной дерматоглифики при судебно-медицинской идентификации личности [Электронный ресурс]](/i/i/4467/191365.png "Возможности ладонной дерматоглифики при судебно-медицинской идентификации личности [Электронный ресурс] Сидоренко Андрей Григорьевич")
