Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Микобактериальные инфекции являются одним из наиболее сложных проблем инфекционной патологии человека и животных. Весьма напряженная эпидемическая обстановка по туберкулезу.
В эпизоотологии микобактериальных инфекций проблема видового состава микобактерий и их региональных особенностей имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как создает основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий. Определение видовой принадлежности выделенных культур микобактерий из организма животных и среды их обитания, позволяет определить ареал их распространения, источники инфицирования и патогенное воздействие на различные виды животных и человека.
Актуальность идентификации микобактерий диктуется необходимостью получения новых данных о возбудителях туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих среди животных в современных условиях ведения животноводства. В большинстве ветеринарных лабораторий идентификация микобактерий осуществляется определением возбудителей туберкулеза и дифференциации нетуберкулезных микобактерий по группам Раньона (скотохромогенные, фотохромогенные, нефотохромогенные и быстрорастущие микобактерий).
Существующие в настоящее время методы идентификации микобактерий (культуральный, биохимический и биологический) являются трудоемкими, длительными, требуют дорогостоящих материалов. Продолжается поиск новых способов идентификации микобактерий.
В дифференциации видов микобактерий туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий широкое признание получили биохимические тесты по определению каталазной, пероксидазной, формамидазной, декарбоксилазной, дегидрогеназной, пиразинамидазной, никотинамидазной, уреазной активности
микобактерий, восстановление нитритов, а также ниациновый, амидазный тесты, реакция с нейтральным красным, метиленовой синью, тесты на липазу, фосфатазу, редуктазу и др., но основным методом как дифференциации, так и определения видов возбудителей туберкулеза является биологическое исследование на морских свинках, кроликах, курах и других видах животных.
По мнению Л.М. Пинчук и соавт. (1990), одним из надежных методов идентификации вида микобактерий является метод газожидкостной хроматографии.
В последнее время проводятся активные исследования по применению ПЦР для диагностики туберкулеза и идентификации микобактерий. Ряд авторов высоко оценивают перспективы применения этого метода (А.Н. Шаров и соавт., 1998; 2000). Другие авторы (Е.М. Скрягина с соавт., 2001) считают, что метод ПЦР обнаруживает ДНК микобактерий, уже не способных к росту на питательных средах и дают ложноположительные результаты, вследствие возможной контаминации. Авторы считают, что интерпретировать положительный результат ПЦР следует в комплексе с результатами микробиологических тестов.
Необходимость оптимизации комплекса методов идентификации видов микобактерий представляется своевременной и актуальной и послужила основанием для выполнения настоящей работы.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение культурально-морфологических, биохимических и других свойств для оптимизации комплекса методов идентификации видов микобактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- выделить культуры микобактерий из проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и из объектов внешней среды;
изучить культурально-морфологические и биохимические свойства выделенных культур микобактерий;
провести исследования по определению внутривидовых различий М. bovis с помощью молекулярно-генетических методов;
испытать метод газожидкостной хроматографии для идентификации выделенных культур микобактерий;
установить возможность идентификации некоторых видов микобактерий с помощью ПЦР;
- оптимизировать схему идентификации основных видов микобактерий с
применением культурально-морфологических, биохимических и молекулярно-
генетических методов.
1.3. Научная новизна. Определен видовой состав микобактерий,
выделяемых от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и
объектов внешней среды. Изучены и охарактеризованы культурально-
морфологические, биохимические и биологические свойства возбудителей
туберкулеза и основных видов нетуберкулезных микобактерий, выделяемых из
биоматериала животных и объектов внешней среды. Впервые показаны
внутривидовые различия культур М. bovis с применением YNTR- типирования
с использованием 6 локусов: ETR-A, ETR-C, V2, V3, V6 и VII молекулярно-
генетических методов. Показана целесообразность применения газожидкостной
хроматографии для идентификации микобактерий. Оптимизирован комплекс
методов идентификации наиболее часто встречающихся видов микобактерий.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
исследований по определению видового спектра микобактерий, выделенных от
крупного рогатого скота и объектов внешней среды, создают основу
дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных
мероприятий при микобактериальных инфекциях. Набор из VNTR- локусов
может использоваться для выяснения источника заражения при
эпизоотологическом обследовании хозяйств по туберкулезу.
Оптимизированный комплекс методов идентификации основных видов микобактерий повышает качество бактериологических исследований и может быть использован в бактериологических и научных лабораториях.
Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г., в методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным, директором ВНИИТИБП, академиком Россельхозакадемии А.Я. Самуйленко и директором ФГУ «Центр ветеринарии» Л.К. Киш в июле 2009г. и «Методические рекомендации по идентификации М.avium subsp. paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденных директором ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г. Методические рекомендации представлены в отделение ветеринарной медицины для утверждения.
1.5 Личный вклад соискателя заключается в бактериологическом
исследовании проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного
рогатого скота и проб из объектов внешней среды, изучении культурально-
морфологических, биологических, молекулярно-генетических свойств
микобактерий, анализе и обобщении результатов исследований, разработке
оптимизированного комплекса методов идентификации наиболее часто
встречающихся видов микобактерий.
1.6 Апробация работы. Материалы работы доложены на
Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию
со дня рождения Я.Р. Коваленко (г. Москва, 2006г.), на заседаниях ученого
совета ВИЭВ (2007,2008гг.), на 15 Международном ветеринарном конгрессе
(г.Москва, 2009). Основные положения, выводы и практические предложения,
изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2010г.).
1.7 Основные положения, выносимые на защиту. Полученные
результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие
положения:
результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств различных видов микобактерий;
внутривидовые различия М. bovis;
результаты применения газовой хроматографии для идентификации микобактерий;
результаты идентификации микобактерий в ПЦР;
оптимизированный комплекс методов идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий.
1.8 Публикация результатов исследований. По материалам
диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в.ч. одна в журнале,
рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.
1.9 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 216
страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,
собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений,
списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 10
рисунками. Список литературы включает 343 источника, в том числе 120
иностранных авторов.
Похожие диссертации на Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий
