Введение к работе
Актуальность темы исследования. Ботулизм - тяжелая интоксикация, возникающая в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины Clostridiumbotulinum ихарактеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы[7].
В настоящее время известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, С, C, D, E, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками [11].
Анализируя литературные данные по диагностике ботулизма, можно заключить, что наиболее перспективными являются люминесцентный анализ с применением флуоресцирующих антител [2], иммуноферментный анализ [1, 12], который находит широкое применение для определения и количественной дифференциации типов ботулинических токсинов [15], реакция непрямой гемагглютинации [9], полимеразная цепная реакция [14]. Вместе с тем,самым распространенным в настоящее время методом индикации ботулинического токсина является биопроба с реакцией нейтрализации токсина на белых мышах [6, 7, 10, 13]. Однако, данный метод занимает длительное время исследования. На сегодняшний день ветеринарная медицина не располагает средствами и методами экспресс – индикации возбудителя ботулизма и обнаружения ботулинического токсина. Всё вышеописанное и обуславливает актуальность настоящей работы и необходимость разработки экспресс анализа для обнаружения возбудителя ботулизма и его токсинов.
Степень разработанности проблемы.Диагностика ботулизма имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных питательных сред для них. Кроме того, единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейротоксины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими анатоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать неэтичным. Помимо этого, биопроба не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения.
Цель и задачи. Целью работыявлялась разработка методов экспресс-индикации возбудителя ботулизма и его токсина в объектах ветеринарного надзора.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1.Разработкаполиспецифической композиционной смеси ботулинических антигенов.
2. Получение высокоактивной поливалентной антиботулинической сыворотки.
3. Созданиеполиспецифического антигенногоэритроцитарногодиагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА.
4. Получение полиспецифическогоантительногоэритроцитарногодиагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА.
5. Разработкаполиспецифического люминесцирующего ботулиническогоглобулина для МФА.
6. Получение полиспецифическогопероксидазногоиммуноферментного коньюгата для экспресс-диагностики ботулизма методом ИФА.
Научная новизна.Впервые составлена восьми компонентная композиция антигенов, включающая в себя корпускулярные антигены возбудителя Cl.botulinum типов A, B, C, D и их анатоксинов, которая в свою очередь послужила основой для получения высокочувствительного полиспецифического антигенного эритроцитарногодиагностикума и препарата для гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивных поливалентных сывороток, на основе которых разработаны: высокочувствительный полиспецифическийантительныйэритроцитарныйдиагностикум, люминесцирующийглобулин, а также иммуноферментныйконьюгат для экспресс-диагностики возбудителей Cl.botulinum и их токсинов в объектах внешней среды и патологическом материале в РНГА, МФА и ИФА. Разработанные диагностикумы дают возможность получать результаты в течение 4-5 ч, в то время как общепринятые методы индикации – биопроба и реакция нейтрализации позволяют получать результат в течение 10 суток.
Теоретическая и практическая значимость. Всестороннее и детальное изучение возбудителей ботулизма и их токсинов позволило разработать метод получения высокоактивной поливалентной антиботулинической сыворотки и на её основе получить высокоспецифичные диагностикумы, которые пригодны для экстренной индикации данного возбудителя и его токсина в объектах внешней среды и патологическом материале в течение 4-5 часов.
Методология и методы исследований.
При проведении исследований применяли методы:
1)клинические – заражение возбудителемCl.botulinum и наблюдение за подопытными животными (белые мыши, морские свинки, кролики). Взятие крови, гипериммунизация;
2)бактериологические – посевы Cl.botulinum на МПА с 2% глюкозой, среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого ими токсина;
3) культурально-морфологические и биохимические – изучениесахаролитических и протеолитических свойства штаммов Cl.botulinum;
4) микроскопические–световая и люминесцентная микроскопия;
5) серологические – постановка РН; РНГА; ИФА;
6)радиобиологические –инактивация возбудителя Cl. botulinumнагамма - установке«Исследователь» с источником излучения 60Со;
7)химические –инактивация возбудителя Cl.botulinum и перевод их токсинов в анатоксины с использованием 40%-ного раствора формалина.
Основные положения, выносимые на защиту:
-разработкаполиспецифической композиционной смеси ботулинических антигенов;
- получение поливалентной гипериммунной антиботулинической сыворотки;
- созданиеполиспецифического антигенного эритроцитарногодиагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА;
- разработка полиспецифическогоантительногоэритроцитарногодиагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА;
- получениеполиспецифическоголюминесцирующего ботулиническогоглобулина для МФА;
- разработка полиспецифическогопероксидазногоиммуноферментногоконьюгата.
Степень достоверности и апробация результатов.Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на производственных совещаниях лаборатории, на ежегодных заседаниях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 2010-2014 г.г. и на Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань,2013 г).
Публикации.По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 5 – в изданиях, включенных в ПереченьВАК Минобрнауки Российской Федерации.
Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, основную часть, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы, список иллюстративного материала и приложения,состоящий из 169 источников, в том числе 84 иностранных авторов и приложение.Диссертация содержит 14 таблиц.
