Введение к работе
Актуальность темы исследования. Надежное благополучие по инфекционным болезням является одним из непременных условий успешного ведения промышленного птицеводства.
Для крупных птицеводческих комплексов особую опасность представляют вирусные болезни, в том числе аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что некоторые инфекционные болезни стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы.
Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит (АДВГГ) (инфекционный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, инфекционный гидроперикардит (ИГП) кур, болезнь Ангара, инклюзионный гепатит, гидроперикардиальный синдром) - высококонтагиозная вирусная широко распространенная болезнь цыплят, основными патологоанатомическими признаками которой являются: накопление транссудата в перикардиальной полости, гепатит и нефрозо-нефрит. АДВГГ регистрируется во многих странах мира, как у бройлеров, так и у несушек. Экспериментально доказано, что в возникновении болезни доминирующая роль принадлежит первой группе аденовирусов, 1 и 4-го серотипов [1] .
Степень тяжести течения АДВГГ в природных условиях во многом зависит от влияния некоторых иммунодепрессивных агентов, таких как вирус инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека и вирусной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой. В связи с этим основная роль в постановке правильного диагноза на ИГП принадлежит лабораторным методам.
Степень разработанности проблемы. Вопросам серологической диагностики АДВГГ птиц посвящены работы ряда авторов [1,3,4], однако разработанные ими методы имеют недостатки. Предложенная [4] реакция диффузионной преципитации в агаровом геле с применением печеночного гомогената в качестве неочищенного антигена уступала по чувствительности ИФА.
Степень тяжести АДВГГ во многом зависит от влияния иммунодепрессивных агентов, таких как вирус болезни Гамборо, болезни Марека и инфекционной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой, вызывая серьезные экономические потери. В связи с этим необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод серологической диагностики.
Цель и задачи. Целью данной работы явилась разработка диагностической тест-системы для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур на основе непрямого метода ИФА.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
получить высокоочищенный антиген возбудителя АДВГГ птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур;
определить оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия;
установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении;
дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;
изучить динамику формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;
провести серологический мониторинг на АДВГГ птиц с применением разработанной тест-системы;
разработать Методические положения по лабораторной диагностике АДВГГ птиц методом иммуноферментного анализа.
Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к возбудителю аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита при тестировании проб сыворотки крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена вируса АДВГГ птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле при АДВГГ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотке крови кур к возбудителю АДВГГ птиц.
Изучена динамика формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ.
Теоретическая и практическая значимость работы. Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу АДВГГ птиц подтверждается положительными результатами испытаний при проведении серологического контроля над распространением АДВГГ птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья цыплят против данной болезни; ретроспективной диагностики АДВГГ птиц по приросту уровня специфических антител.
Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии методические положения «Лабораторная диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита птиц методом иммуноферментного анализа» от 02 июля 2013 г.
Методология и методы исследования
Вирус: В работе использовали возбудитель аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур, производственный штамм “Т 12” 4-го серотипа.
Инкубационные яйца фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 50 штук; цыплята 28-суточного возраста, полученные из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням, 60 голов.
Растворы и реактивы: калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, х.ч.; натрия хлорид, х.ч.; 0,05М фосфатно-цитратный буфер; 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер и 0,01М фосфатно-солевой буфер; перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»; ортофенилендиамин фирмы «Sigma»; твин 20 (Р7949) фирмы «Sigma»; агар «Дифко».
Получение вируса ИГП на цыплятах. Для постановки опытов использовали СПФ цыплят 15 – суточного возраста. Заражение проводили подкожно. Материалом для инфицирования служила 10% суспензия, приготовленная из печени павших цыплят с признаками АДВГГ, по общепринятой методике.
Инактивацию вируса проводили формальдегидом в конечной концентрации 0,1% при температуре +370С и экспозиции 48 часов.
Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП).
Постановка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. РДП в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухтерлони [2], с использованием 1% агара «Дифко».
Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG курицы. Конъюгат получали модифицированным методом периодатного окисления [5] при совместной работе с ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи», г. Москва.
Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.
Положения, выносимые на защиту:
тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к вирусу АДВГГ в сыворотке крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций компонентов и условий их взаимодействия, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;
результаты сравнения разработанной тест-системы и реакции диффузионной преципитации в агаровом геле;
данные динамики выработки антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;
результаты серологического мониторинга на АДВГГ с применением разработанной тест-системы.
Степень достоверности и апробация результатов.
Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных вирусологических, биохимических и серологических методов исследований.
По результатам научных исследований опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, и 4 статьи опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов.
Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2010-2013гг.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Аграрная наука ХХI века. Актуальные исследования и перспективы (Санкт-Петербург-Пушкин, 2013); «Инновационные решения актуальных проблем в АПК»: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Екатеринбург, 2013). Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, основная часть, заключение, список сокращений, список литературы и приложения.
Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 134 источников, из которых 87 зарубежных.
