Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Микрофлора мяса и последствия ее развития 7
1.2. Химические способы консервирования мяса 16
1.3. Слюнные железы и выделяемые ими биологически активные вещества 36
1.4. Лизоцим, его свойства и применение 39
1.5. Заключение 42
2. Методика постановки исследования; 45
2.1. Постановка опытов и схема проведения эксперимента 45
2.2. Методы исследования 47
3. Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение 55
3.1. Исследование возможностей использования слюнных желез при выработке мясных продуктов 55
3.2. Разработка технологии получения препарата памалин из слюнных желез крупного рогатого скота 60
3.3. Исследование физико-химических свойств препарата памалин 73
3.4. Исследование противомикробных свойств препарата памалин 85
3.5. Исследование безвредности препарата памалин 96
3.6. Возможные пути использования памалина в мясной промышленности 99
3.6.1. Использование памалина для поверхностной обработки мяса 99
3.6.2. Выбор способа обработки мяса препаратом па малин 109
3.6.3. Использование памалина для консервирова ния крови убойных животных ИЗ
Заключение 118
Выводы 122
Литература
- Микрофлора мяса и последствия ее развития
- Слюнные железы и выделяемые ими биологически активные вещества
- Постановка опытов и схема проведения эксперимента
- Исследование возможностей использования слюнных желез при выработке мясных продуктов
Введение к работе
ХХУІ съездом КПСС и Продовольственной программой СССР на период до 1990 года, принятой майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, перед специалистами мясной промышленности поставлена задача в возможно сжатые сроки обеспечить производство в широком ассортименте высококачественных мясных продуктов питания /I, 2/.
В последние годы ученые и практики мясной индустрии многих стран уделяют большое внимание вопросам, связанным с созданием условий, исключающих загрязнение мяса микрофлорой, и гарантирующих безопасность употребления его в пищу. Особую угрозу для потребителя представляют микроорганизмы, участвующие в процессах гнилостного распада мяса и являющиеся причиной большинства отравлений, вызываемых мясными продуктами /104,159,160/.
В настоящее время в промышленных условиях внедряется такая техника и технология, которые удовлетворяют современным требованиям санитарии и гигиены и предупреждают пищевые интоксикации. Наряду со строгим санитарным контролем скота и соблюдением правил гигиены при убое, переработке, упаковке и реализации мясопродуктов, в мировой практике используют способы стерилизации мяса замораживанием, обработкой паром, горячей водой, СВЧ-энер-гией, облучением ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, ультразвуковыми колебаниями и т.д. /4,54,56,67,74/.
Все более широкое распространение получают разнообразные химические методы консервирования мяса с помощью веществ, подавляющих рост и развитие бактерий, дрожжей, плесеней. К числу консервантов, широко используемых в мясной промышленности, относятся поваренная соль, нитриты, нитраты, некоторые органические
кислоты, эфиры, фитонциды, активные и инертные газы и др. /49, 61,47,10,42,128,70,45,52,155,190/.
В периодической литературе и патентной документации появляются сообщения о высоком стерилизующем эффекте, который достигается при обработке мяса синтетическими антибиотиками, ферментами растительного или микробиального происхождения, алкалоидами, сапонинами и т.п. /7,10,16,27,46,65,175/. Однако эти препараты, при производстве которых, как правило, осуществляются многоступенчатые технологические процессы, являются дорогостоящими и в ряде случаев не лишены токсических свойств.
Вместе с тем при переработке скота на пищевые и медицинские цели накапливаются разнообразные отходы, содержащие биологически активные вещества, оказывающие бактерицидный или бактериостати-ческий эффект. Рациональное использование таких отходов является важной и актуальной народнохозяйственной задачей.
Среди вторичных продуктов убоя скота, не имеющих самостоятельного пищевого значения, наше внимание привлекли слюнные железы, содержащие фермент лизоцим, обладающий широким спектром противомикробного действия и уже неоднократно успешно использовавшийся различными исследователями в качестве биологического антисептика /27,30,34,35,189,152/.
Принимая во внимание достаточно большие ресурсы этого сырья (ежегодно можно собирать до 36450 т слюнных желез), а также учитывая известные литературные данные о том, что концентрация лизо-цима в слюне значительно превышает уровень этого фермента во многих других органах и тканях животных /13/, мы поставили перед собой задачу изучить возможности выделения из слюнных желез убойных животных веществ, обладающих противомикробным действием и создать препарат, способствующий улучшению санитарного состояния
мясного сырья и удлинению сроков его хранения.
Б настоящей диссертационной работе изложены результаты экспериментов, обосновывающие технологию получения такого препарата, и представлены данные по изучению его свойств и использованию в мясной промышленности в качестве консерванта.
Микрофлора мяса и последствия ее развития
В свете современных представлений мясо, получаемое от убоя здоровых и отдохнувших животных, практически не содержит микроорганизмов, и принято считать, что микрофлора из пищеварительно го тракта проникает в различные органы и ткани только при заболевании животного или понижении резистентности организма.
Загрязнение мяса, используемого для выработки мясопродуктов и реализация через торговую сеть населению, как правило, происходит экзогенным путем - при разделке туш, хранении и транспортировке мяса, при его переработке вследствие попадания бактерий с кожного покрова животного, из содержимого желудочно-кишечного тракта, с водой, используемой для туалета туш, из воздуха, транспортных средств, с одежды и обуви работников и т.д. /20, 67, 169, 179/.
В настоящее время не вызывает сомнений, что интенсивность размножения микробов и их проникновения в ткани зависит от первоначальной степени обсеменения туши, температуры и относительной влажности воздуха, санитарного состояния окружающей среды и ряда других факторов /67,96/. Определенное влияние на бактериологические показатели мяса оказывают и способы убоя животных. Проведенное сравнительное гигиеническое исследование говяжьих туш после убоя в горизонтальном и вертикальном положении на конвейере показало, что в последнем случае достигается ряд преимущества основном за счет улучшения санитарно-гигиенического состояния туши /106/.
Микрофлора парного мяса здоровых животных представлена ограниченным количеством родов и видов микроорганизмов. Размножение бактерий происходит медленно и лаг-фаза длится не менее 40 часов. Среди микрофлоры, контаминирующей мясо, могут встречаться организмы, являющиеся возбудителями ящура, ластереллеза, бруцеллеза, туберкулеза, Ку-лихорадки, туляремии, лептоспирозов, листерелле-за и др. /Ill, 112/. В бактериологическом исследовании парного говяжьего мяса (182 образца) было установлено общее количество клеток бактерий в I г от Ю6 до Ю8 /177/. При этом количество энтеробактерий и бактерий группы кишечной палочки составляло IOVEO6, E.coli Ю3-Ю5, Д-стрептококков I02-I04, Staphylococ о cus aureus 3-Ю , C.perfringens менее 10. В 32 образцах были зарегистрированы единичные количества сальмонелл. Близкая картина наблюдалась группой итальянских авторов /101/. Проведенные на протяжении года исследования смывов 6 частей 25 туш телят и 25 говяжьих туш (шеи, лопатки, задней четверти, реберной части, брюшной и грудной полостей) на содержание психро-фильной микрофлоры показали, что внешняя часть туши - шея, лопатка, задняя четверть и реберная часть, - более обсеменена психро-филами, чем внутренняя часть (грудная и брюшная полости) /в/, У забитых телят в различных топографических областях установлено более слабое обсеменение психрофилами, чем у взрослых животных, причем количество бактерий увеличивается осенью и зимой. Из 230 изолированных штаммов психрофилов 37,4% дифференцированы как Pseudomonas sp., 26,08% -Aeromonas sp., 13,48% - Alcaligenes , 12,17% - Piavobacterium sp., 6,08% - Acinetobacter sp., 3,48% -Xantomonas sp. И 1,3% - vibrio sp. .
Слюнные железы и выделяемые ими биологически активные вещества
При промышленных процессах переработки мяса на предприятиях накапливаются отходы сырья, рациональное использование которых создает дополнительные резервы для успешного выполнения народнохозяйственных планов.
К числу продуктов переработки скота, не имеющих пищевого значения, относятся слюнные железы, представляющие собой сложный многокомпонентный орган с разнообразными функциями.
Слюнные железы у человека и животных представлены парными крупными и непарными мелкими железами. К первой группе относятся главные, или большие слюнные железы - околоушные ( gi.parotis )» подчелюстные ( gl.submaxillares ), подъязычные ( gi.sirt)lingu-aies ). Ко второй группе слюнных желез относятся мелкие железки слизистой полости рта. По их расположению говорят о губных железах ( gl.labiales ), язычных ( gi.iinguaies )» щечных ( gi.-ыю-cales ), небных ( gl.palatinae ), десенных ( gi.icisicales., gl.retromlares ). Вес их у человека колеблется от 20 до 30 г, а у крупного рогатого скота - от 80 до 120 г /38/. Слюнные железы в пределах разных отрядов и семейств имеют некоторые различия, но в целом их можно охарактеризовать как сложные разветвленные, обычно альвеолярные или трубчато-альвеолярные (у жвачных), вырабатывающие преимущественно белковый секрет /9/.
В последние годы установлено, что слюна животных и человека содержит сложную систему веществ, обладающую бактерицидными свойствами. В ней обнаружено свыше 50 ферментов, которые относятся к гидролазам, оксидоредуктазам, трансферазам, лиазам, изоме-разам /18,36/.
Наибольшее практическое значение приобретает в настоящее время исследование ферментов, действующих на основные биологические полимеры - мукополисахариды, нуклеиновые кислоты, белки, исполняющие, по всей вероятности, ведущую роль среди факторов естественного иммунитета организма. К ним относятся такие ферменты, как лизоцим, пероксидаза, нуклеаза, параллельно осуществляющие и пищеварительную функцию /18/.
Основным источником лизоцима в ротовой полости являются слюнные железы. Главные закономерности антибактериальной активности лизоцима были изучены уже в течение первого десятилетия после его открытия в 1922 г. /109/. Оказалось, что спектр литического действия лизоцима достаточно широк. Наиболее чувствительны к нему грамположительные сапрофиты родов микрококков и сарцин, но он подавляет также некоторые штаммы патогенных микробов, в том числе кокки, бациллы, вибрионы. Лизоцим лизирует клеточные оболочки как живых, так и убитых бактерий в условиях аэробиоза и анаэробиоза, резко усиливает повреждающее действие на микроорганизмы поверхностно-активных веществ /22,127/.
Следует отметить также способность лизоцима оказывать защитное действие с помощью механизмов, не зависящих от его бакте-риолитического эффекта. Так, хорошо известна способность фермента вызывать агглютинацию как резистентных, так и чувствительных к литическому действию видов микроорганизмов, инактивировать токсины полисахаридной природы и тормозить процессы дыхания даже в бесклеточных системах микроорганизмов /13/.
В литературе сложилось устойчивое мнение о том, что в защите органов пищеварительной и дыхательной систем от инфекций значительную роль играют нуклеазы слюны /5,11/, РНК-аза (КФ 2.7. 7.16) и ДНК-аза (КФ 3.1. 5.5), принимающие участие в расщеплении нуклеиновых кислот. Биологическая роль нуклеазы слюны заключается в деградации нуклеиновых кислот вирусов, что может играть существенное значение в защите организма от проникновения инфекционного фактора через полость рта при различных вирусных и инфекционных заболеваниях /51,87/.
Большого внимания заслуживают протеолитические ферменты (пептидогидролазы) слюнных желез, такие как саливаин, гландула-ин, калликреин, катепсины /108,125/. Столь же широко распространенным в природе фактором естественного иммунитета является пероксидаза. В настоящее время среди пероксидаз, имеющих непосредственное отношение к излагаемому вопросу, принято различать два фермента - пероксидазу (КФ I.II. 1.7) и иодидпероксидазу (КФ I.II. 1.8). Способность образовывать пероксидазу с защитной целью присуща органам на всем протяжении дыхательного и пищеварительного трактов /18/. В присутствии соответствующего донора и акцептора электронов пероксидаза быстро понижает вирулентность различных вирусов, оказывает бактериостатическое и бактерицидное действие на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы /97/. Непременным условием реализации каталитического и антимикробного действия пероксидаз является обеспечение контакта с перекисью водорода.
Представляют интерес исследования, касающиеся также потенцирования бактерицидного эффекта радикалами, образуемыми окси-дазами или миелопероксидазой. Так, грамотрицательные бактерии не чувствительные к лизоциму, быстро лизируются им при добавлении в среду аскорбиновой кислоты и Н202 - системы, которая продуцирует свободные радикалы /139/.
Постановка опытов и схема проведения эксперимента
В соответствии с поставленными в работе задачами исследования проводили в несколько этапов.
Вначале была предпринята попытка использовать слюнные железы крупного рогатого скота для выработки мясопродуктов и увеличить их сроки хранения. Второй этап работы заключался в создании противомикробного препарата из слюнных желез КРС и изучения его свойств. В дальнейшем изучали эффект действия этого препарата на мясо.
ЧВ качестве материала для исследования были использованы слюнные железы крупного рогатого скота, собранные в парном состоянии до или после отделения голов на подвесных путях конвейера Каунасского мясокомбината в соответствии с общими требованиями, предусмотренными при заготовке эндокринно-ферментного сырья.
Хранение слюнных желез осуществляли в холодильных камерах при температуре минус 18-20С.
Материалами для исследований также служили промежуточные продукты технологического процесса (экстракты, концентраты, порошки) и получаемый готовый продукт - противомикробный препарат памалин, выработанные на Каунасском заводе эндокринных препаратов и Ростовском-на-Дону мясокомбинате.
Изучение противомикробного действия препарата проводили на полуфабрикатах из говядины высшего сорта.
В экспериментах использовали взятые через 96 часов после убоя охлажденные мускулы животных 2-3-летнего возраста средней упитанности, Образцы мяса обрабатывали путем погружения или опрыскивания водными растворами препарата, а контрольные образцы - водой и в процессе хранения проверяли микробиальную обсемененность, микроструктурные изменения и орга-нолептические показатели.
Определяемые показатели 1. Содержание влаги 2. Содержание белка 3. Содержание жира 4. Содержание золы 5. Аминокислотный состав 6. Величина рН 7. Растворимость белковых веществ 8. Поглощение в ультрафиолетовой и видимой области спектра 9. Электрофорез в 1% полиакриламидном геле 10. Хроматографические исследования 11. Гиал уронидазная активность 12. Протеолитическая активность 13. Эластолитическая активность 14. Амилолитическая активность 15. Литическая (лизоцимная) активность 16. Микробиологические исследования х 17. Токсикологические исследования 18. Микроструктурные исследования 19. Водосвязывающая способность 20. Органолептические исследования 2.2. Методы исследования
Для изучения свойств препарата памалина, а также для оценки качества обработанного мяса в соответствии со схемой проведения эксперимента предусматривалось определение комплекса показателей с привлечением соответствующих методов исследования, применяемых в органической химии, биохимии, биологии и микробиологии .
Содержание влаги определяли методом высушивания навески в сушильном шкафу при температуре Ю2-Ю5С до постоянной массы /89/. х) Микробиологические исследования проводили при консультации к.б.н. Багдонавичене З.П. и к.в.н.Стратилатовой Н.П.
Содержание белка рассчитывали по данным определения общего азота минерализацией, микрометодом Кьельдаля /89/. Содержание жира определяли по классическому методу Соксле-та /89/. Содержание золы определяли методом минерализации в муфельной печи при температуре 600-800С до постоянной массы /89/. Аминокислотный состав препарата определяли методом ионообменной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе фирмы " CJeol " (Япония) после предварительного гидролиза навесок в б н растворе соляной кислоты. Определение количества водородных ионов (величина рЮ растворов, экстрактов и жидкостей проводили потенциометрическим методом с помощью Ионометра универсального ЗВ-74 со стеклянным электродом при температуре 20С. Величину рН мяса определяли с помощью портативного измерителя концентрации водородных ионов ИХ-3200.
Исследование возможностей использования слюнных желез при выработке мясных продуктов
Присутствие в слюнных железах лизоцима, обладающего широким спектром противоиикробной активности, позволило поставить вопрос об изучении возможности применения этого сырья при выработке вареных мясопродуктов с целью увеличения сроков их хранения, поскольку они подвергаются быстрой микробиологической порче.
Прежде всего представляло интерес установить, какое количество лизодима содержится в слюнных железах основных видов убойных животных.
1. Как видно из данных таблицы 3.1.I, наиболее высокое содержание лизоцима было зарегистрировано в слюнных железах крупного рогатого скота. Кроме того, у свиней и, особенно, у баранов, выделение этих желез связано со значительными трудностями. В этой связи в дальнейших экспериментах мы сочли целесообразным использовать только слюнные железы крупного рогатого скота.
В настоящее время слюнные железы в промышленных условиях не собираются, а направляются вместе с головой на переработку. Поэ тому перед нами возникла необходимость разработать технологическую инструкцию по сбору слюнных желез крупного рогатого скота (приложение № I), согласно которой сырье собирали на мясокомбинате до отделения или после отделения голов на подвесных путях конвейера.
В экспериментах, проведенных совместно с сотрудниками Северо-кавказского филиала ВНИИМП, добавляли слюнные железы к мясному фаршу и вырабатывали мясопродукты. При выработке ветчины вареной в оболочке к мясному фаршу добавляли 3 или 5% измельченных слюнных желез, а при выработке колбасы вареной особой высшего сорта I, 3, 5 или 7% к массе сырья взамен мяса. Также готовили котлеты с добавлением I, 3 или 5% слюнных желез.
Как показали проведенные исследования (таблица 3.1.2), использование измельченных слюнных желез при производстве ветчины вареной в оболочке повышает на 6,01-6,5% содержание связанной влаги в сырье. При выработке колбасы вареной высшего сорта выход готового продукта увеличивался на 1,8-3,1% по сравнению с контролем. Это можно объяснить тем, что в слюнных железах содержится довольно много глюкопротеидов (около 5,2 г/ЮОг), которые способны связывать воду (I г глюкопротеидов связывает до 30 мл воды и не коагулирует при І00С в течение нескольких часов) /25/.
Важно подчеркнуть, что по результатам дегустационных оценок качество мясопродуктов, выработанных с добавлением слюнных желез, не ухудшалось по сравнению с контрольными образцами (таблица 3.1.3).
Более того, в результате дегустации котлет (таблица 3.1.3), приготовленных из говяжьего фарша с добавлением 1-5% измельченных слюнных желез, по основным органолептическим показателям была выявлена отчетливая разница в сравнении с контролем в пользу опытных образцов.
По результатам лабораторных и производственных проверок нами были представлены материалы авторской заявки во ВНИИГПЭ и получено авторское свидетельство СССР № 938887 на "Способ производства колбасных изделий" (приложение № 2).
Вместе с тем проведенные исследования показали, что явные признаки порчи опытных и контрольных мясопродуктов при хранении в условиях низких плюсовых температур (4-6С) наблюдается примерно в одно и то же время (таблица 3.1.2). Можно было предположить, что количество лизоцима, содержащегося в слюнных железах, добавляемых к мясопродуктам, оказывается недостаточным для проявления противомикробного эффекта.
Действительно, как нами было установлено, в I г слюнных желез крупного рогатого скота содержится около 1,5 ед лизоцима, поэтому при добавлении даже 1% слюнных желез к массе сырья в I г фарша будет содержаться всего около 0,1 ед фермента. По данным З.В.Ермольевой (1968 г.) /31/, для подавления развития микроорганизмов требуется от 0,31 до 5 ед на I мл среды. В этой связи представлялось целесообразным провести исследования по разработке технологии препарата, содержащего лизоцим и другие противомикроб-ные вещества слюнных желез в более концентрированном виде.
При разработке технологии противомикробного препарата из слюнных желез крупного рогатого скота, предназначаемого для обработки мясного сырья в промышленных масштабах, мы поставили перед собой задачу не добиваться высокой степени его очистки, поскольку это привело бы к созданию продукта с высокой стоимостью. Так, например, недавно полученный Н.С.Даниловой /27/ лизоцим из селезенки крупного рогатого скота имел стоимость около 1500 руб. за I кг. Кроме того, из данных литературы известно, что с увеличением степени очистки возрастает скорость инактивации биологически активных веществ при воздействии различных факторов внешней среды /28,58,62/.
Первым этапом выделения целевого продукта из сырья животного происхождения является проведение процесса экстракции.
Учитывая физико-химические и биологические свойства содержащихся в слюнных железах веществ, обладающих противомикробной активностью /13,32,28,58,62/, мы выбрали в качестве экстрагентов воду, 0,15 М раствор NaCl , 0,1 М уксусную кислоту и 1%-ный раствор лимонной кислоты.
Слюнные железы измельчали на мясорубке с диаметром отверстий внешней решетки 2-3 и 6-8 мм или на куттере (диаметр частиц около 0,1-0,3 мм).
