Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.Обзор литературы 17
1.1. Фермент микробного происхождения - циклодекстринглюкано-трансфераза 17
1.2. Циклодекстриногенные бактерии 19
1.2.1. Paenibacillus macerans 19
1.2.2. Bacillus circulans 20
1.2.3. Алкалофильные бациллы 21
1.2.4. Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН 21
1.2.5. Термотолерантные циклодекстриногены 22
1.2.6. Продуценты ЦГТ-аз, не относящиеся к порядку Bacillales 22
1.3. Выбор продуктивного штамма для процессов получения ЦГТ-азы 23
1.3.1. Источники культур 23
1.3.2. Накопительные среды 24
1.3.3. Дополнительный анализ выделенных штаммов 24
1.4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов-
продуцентов ЦГТ-аз 25
1.4.1. Источники углерода 25
1.4.2. Источники азота 26
1.4.3. Источники фосфора 26
1.5. Физико-химические свойства бактериальных ЦГТ-аз 27
1.6 Структура ЦГТ-аз 33
1.7. Реакции катализируемые ЦГТ-азами 34
1.7.1. Реакция циклизации 35
1.7.2. Реакция диспропорционирования 37
1.7.3. Реакция связывания 37
1.7.4. Гидролитическая (декстринизирующая) активность 38
1.7.5. Суммарная схема реакции 38
1.8. Методы выделения и очистки ЦГТ-аз 39
1.8.1. Ультрафильтрация 40
1.8.2. Осаждение органическими растворителями 42
1.8.3 .Высаливание 43
1.9. Хроматографические методы очистки ЦГТ-аз 48
1.9.1. Гидрофобная хроматография 49
1.9.2. Ионообменная хроматография 49
1.9.3. Металлохелат аффинная хроматография 51
1.9.4. Аффинная хроматография. Синтез аффинных сорбентов с использованием ЦД 53
1.10. Строение, свойства, методы получения ЦД и комплексов включений 55
1.10.1. Строение ЦД 55
1.10.2. Свойства ЦД 57
1.10.3. Методы получения ЦД 60
1.10.3.1. Типы субстратов для получения ЦД 62
1.10.3.2. Методы предобработки субстратов 63
1.10.4. Комплексы-включения с ЦД 64
1.10.4.1. Получение комплексов в водных растворах ЦД 67
1.11. Применение ЦД в пищевой промышленности 68
ГЛАВА 2.Экспериментальная часть 72
2.1. Объекты, материалы и методы исследований 72
2.1.1. Объект исследования 72
2.1.2. Питательные среды 72
2.1.3. Крахмал, используемый для циклизации 74
2.1.4. Ферментные препараты 75
2.1.5. Ароматические вещества, используемые для получения комплексов включений с а-ЦД 75
2.1.6. Препарат а-ЦД 76
2.1.7. Приборы 76
2.1.8. Методы 77
2.1.8.1. Определение вязкости растворов крахмала 77
2.1.8.2. Определение РВ по методу Шомодьи-Нельсона 78
2.1.8.3. Определение декстрозного эквивалента 78
2.1.8.4. Определение белка по методу Лоури 79
2.1.8.5. Определение содержания влаги в образцах навесок исследуемого вещества 79
2.1.8.6. Методы определения ферментативных активностей 79
2.1.8.6.1. Качественное определение а-ЦГТ-азной активности методом Тильдена-Хадсона 79
2.1.8.6.2. Количественный метод определения активности а-ЦГТ-азы..80
2.1.8.6.3. Определение амилолитической активности фотоколориметрическим методом 82
2.1.8.6.4. Измерение активности р-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом 82
2.1.8.6.5. Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона) 85
2.1.8.7. Концентрирование культуральной жидкости методом ультрафильтрации 86
2.1.8.8. Осаждение ферментов органическими растворителями 86
2.1.8.9 Получение лиофилизированных ферментных препаратов 86
2.1.8.10. Электрофорез 87
2.1.8.10.1. Изучение степени чистоты фермента с помощью диск-электрофореза 88
2.1.8.11. Диализ 88
2.1.8.12. Методы определения физико-химических параметров а-ЦГТ-
азы 88
2.1.8.12.1. Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы 88
2.1.8.12.2. Определение термостабильности а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.3. Определение рН - оптимумов действия а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.4. Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-
азы 89
2.1.8.12.5. Определение влияния ЭДТА и ионов металлов на активность а-ЦГТ-азы 89
2.1.8.12.6. Определение аминокислотного состава белка 90
2.1.8.13. Хроматографические методы очистки а-ЦГТ-азы 90
2.1.8.13.1. Гидрофобная хроматография 90
2.1.8.13.2. Синтез аффинных сорбентов а-ЦД- сефароза4В 91
2.1.8.13.3. Аффинная хроматография а-ЦГТ-азы 91
2.1.8.14. Определение ЦД методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии ! 91
2.1.9. Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта : 93
2.1.10. Рецептура кондитерских изделий (конфеты «Помадка сахарная» и «Помадка сливочная»), приготовленных с добавлением комплексов включений 95
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 96
2.2.1 Скрининг ЦГТ-активных культур микроорганизмов из природных мест обитания 96
2.2.2. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма 1024 ^ 100
2.2.3. Филогенетические особенности штамма 1024 105
2.2.4. Питательные среды, оптимальные для культивирования,
поддержания и хранения микроорганизма Paenibacillus macerans 1024 109
2.2.4.1.Хранение и поддержание культуры Paenibacillus macerans 1024 109
2.2.4.2. Выращивание культуры Paenibacillus macerans 1024 на жидких питательных средах 112
2.2.4.3. Изучение влияния рН исходной питательной среды на биосинтез а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024 113
2.2.4.4. Разработка способа получения посевного материала 114
2.2.4.5. Изучение динамики биосинтеза фермента а-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1024 на оптимизированной по составу питательной среде 116
2.2.5. Определение физико-химических свойств неочищенной а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 117
2.2.5.1.Определение рН-стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 117
2.2.5.2.Определение рН-оптимума а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 118
2.2.5.3.Определение температурного оптимума действия а-ЦГТ-азы Paenibacillus sp. 1024 119
2.2.5.4. Определение температурной стабильности а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1024 120
2.2.6. Разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х из культуральной жидкости продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ 122
2.2.6.1.Подбор условий удаления балластных веществ из культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 123
2.2.6.2.Разработка условий ультрафильтрации для очистки и концентрирования культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 125
2.2.6.2.1.Подбор мембраны для проведения процесса ультрафильтрации культуральной жидкости 125
2.2.6.2.2. Влияние рабочего давления на процесс ультрафильтрации культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ 131
2.2.6.2.3. Влияние степени концентрирования раствора а-ЦГТ-азы
Paenibacillus macerans 1АМБ на процесс ультрафильтрации 132
2.2.6.3. Разработка условий получения осажденного ФП а-ЦГТ-азы
Paenibacillus macerans 1 АМБ 136
2.2.6.3.1.Исследование влияния концентраций различных
органических растворителей на выход препарата а-ЦГТ-азы Paenibacillus
macerans 1 АМБ 136
2.2.6.3.2. Влияние различных концентраций этанола (об%) на выход препарата а-ЦГТ-азы из УК 138
2.2.6.3.3. Влияние рН на осаждение а-ЦГТ-азы из УК культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1 АМБ 139
2.2.6.4. Лиофилизация препарата а-ЦГТ-азы 140
2.2.6.5. Исследование физико-химических характеристик ФП а-ЦГТ-азы Г20Х 143
2.2.6.5.1. Определение рН-оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы
Г20Х 143
2.2.6.5.2. Определение рН-стабильности препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 144
2.2.6.5.3. Определение температурного оптимума действия препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 145
2.2.6.5.4. Определение термостабильности препарата а-ЦГТ-азы Г20Х 145
2.2.6.6.Изучение динамики изменения а-ЦГТ-азной активности в процессе биоконверсии крахмала в а-ЦД 146
2.2.6.7. Анализ микрофлоры ФП а-ЦГТ-азы Г20Х 148
2.2.7. Разработка хроматографических приемов очистки а-ЦГТ-
азы 150
2.2.7.1. Влияние ионов металлов и этилендиаминтетраацетата на
активность а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 150
2.2.7.2. Очистка а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с использованием гидрофобной хроматографии 152
2.2.7.3. Очистка а-ЦГТ-азы с использованием аффинной хроматографии 154
2.2.7.4 Изучение свойств а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1 АМБ 155
2.2.7.4.1. Определение молекулярной массы фермента 155
2.2.7.4.2. Определение аминокислотного состава белка высокоочищенного препарата а-ЦГТ-азы 158
2.2.8. Разработка условий ферментативной конверсии крахмала вальфа-ЦД 159
2.2.8.1. Исследование поведения 2% растворов крахмала различного типа в процессе термообработки 160
2.2.8.2. Определение выхода а-ЦЦ из различных видов крахмалов под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1 АМБ 161
2.2.8.3. Исследование поведения картофельных крахмалов различных марок в процессе термообработки 163
2.2.8.4.Выбор метода разжижения для приготовления концентрированных растворов картофельного крахмала 164
2.2.8.4.1. Химический гидролиз крахмала 165
2.2.8.4.2. Предобработка крахмала ультразвуком 167
2.2.8.4.3. Ферментативная предобработка крахмала в биотехнологии ЦД 168
2.2.8.4.3.1.Предобработка крахмала ферментными препаратами а-амилаз 168
2.2.8.4.3.2. Предобработка крахмала солодовой вытяжкой 173
2.2.8.4.3.3. Предобработка крахмала а-ЦГТ-азами 175
2.2.8.5.Определение выхода а-ЦД из картофельного крахмала, предобработанного различными методами под действием а-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 177
2.2.8.6. Интенсификация процесса получения ЦД с использованием комплексной предобработки крахмала 179
2.2.8.6.1. Последовательная предобработка крахмального
клейстера УЗ и а-ЦГТ-азами {Paenibacillus macerans 1024 и Paenibacillus macerans 1 АМБ) 179
2.2.8.7. Лабораторная двухступенчатая схема получения а-ЦД с
использованием УЗ и а-ЦГТ-азы Г10Х Paenibacillus macerans 1024 для
предобработки крахмального клейстера и а-ЦГТ-азы Г20Х Paenibacillus macerans 1 АМБ для циклизации 182
2.2.9. Получение комплексов включений ароматических веществ с а-ЦД 184
2.2.9.1 Получение комплекса включения а-ЦД с -кристаллическим ванилином 184
2.2.9.2 Получение комплекса включения а-ЦД с эфирным маслом апельсина 187
2.2.10. Апробация комплексов включений ароматообразователей с а-ЦД в технологии помадных конфет 190
2.2.10.1.Приготовление кондитерских изделий по традиционной технологии с применением комплексов включений 191
2.2.10.2. Характеристика кондитерских изделий при хранении 193
Общие выводы 199
Список литературы
- Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН
- Крахмал, используемый для циклизации
- Определение содержания влаги в образцах навесок исследуемого вещества
- Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта
Введение к работе
Актуальность темы. Циклодекстрииы (ЦД) относятся к классу углеводов, точнее олигосахаридов, получаемых ферментативным путем из крахмала Являясь представителями одного гомологического ряда, они различаются количеством звеньев глюкозы в макроциклах, и обозначаются буквами греческого алфавита -а, р, у, 5 и т д в сторону увеличения длины кольца
Для биохимической трансформации крахмала в ЦД используется фермент, циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза), относящийся к подклассу микробных трансфераз (К Ф 2 4 1 19), а именно, к циклизующим трансферазам, осуществляющим реакцию переноса и присоединения остатков Сахаров на —ОН группы других Сахаров
Молекулы ЦД имеют гидрофильную внешнюю поверхность (обусловливающую хорошую растворимость циклических олигосахаридов в воде) и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений Последние, попадая в растворы ЦД, проникают в полость, остаются там, удерживаемые силами гидрофобных и других взаимодействий, и меняют свои физико-химические свойства нерастворимые субстанции становятся растворимыми, обладающие горьким вкусом - безвкусными, пахучие - лишенными запаха, летучие - нелетучими, а нестабильные - стабильными Вследствие уникального строения ЦД широко используются за рубежом в самых различных отраслях промышленности В пищевой промышленности они применяются для введения в рецептуры пищевых продуктов витаминов и ароматических веществ, повышая их растворимость в воде
Среди ведущих компаний на мировом рынке ЦД бесспорное первенство принадлежит китайским, японским (Hayashibara Biochem Lab , Rikagaku Kenkyusho, Hako Co, Kikkoman Corp и др ) и американским фирмам (Corn Products Сотр., СРС Intern Inc , American Maize Techn Inc , Genetics Inst и др ) Наиболее дешевым продуктом является Р-ЦД промышленного производства, доступный по ценам от 7 до 25 долларов США за килограмм а - и у-ЦД> имеют себестоимость (и соответственно цену) в десятки раз более высокую
В России производство ЦД отсутствует, поэтому, разработка научно-обоснованных, высокоэффективных биотехнологий ЦГТ-аз и ЦД является актуальной проблемой
Решению задач получения очищенного микробного ферментного препарата а-ЦГТ-азы, разработки биотехнологии ЦД и комплексов включений на их основе посвящена данная работа
Цели и задачи исследования
Основные цели диссертационной работы состояли в разработке технологии ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием штамма-продуцента Paenibacillus macerans 1АМБ и интенсификации биотехнологии а-ЦД на его основе с последующим получением комплексов включений с ароматическими веществами Для достижения поставленных целей решались следующие задачи
скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора термостабильного а-ЦГТ-активного штамма Идентификация штамма-продуцента а-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его культуральных, морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических особенностей,
подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования с целью накопления максимальной активности а-ЦГТ-азы,
разработка технологии получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х,
интенсификация биотехнологии а-ЦД,
получение комплексов включений а-ЦД с ароматическими веществами и апробация полученных комплексов в технологии кондитерских изделий
Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02 434 11 3007 по теме ЖС-12 4/004 «Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов» Научная новизна работы.
На основе анализа данных, полученных экспериментальным путем, выявленных зависимостей накопления а-ЦГТ-азной активности штаммом Paenibacillus macerans 1АМБ от условий культивирования, параметров выделения и очистки, разработана технология ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х На основании нового штамма продуцента термостабильной а-ЦГТ-азы, полученного путем скрининга, и экспериментально обоснованных зависимостей выхода а-ЦД от способов предварительной обработки крахмала, усовершенствована биотехнология получения а-ЦД В результате экспериментально выявленных условий включения веществ в полость а-ЦД, получены их комплексы с ароматическими веществами
Для экспериментального и теоретического обоснования путей создания биотехнологий а-ЦГТ-азы Г20Х, а-ЦД и получения комплексов включений на их основе, было произведено следующее
- Проведен скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв, и получен новый термостабильный (top, = 65С) штамм продуцент с максимальной а-ЦГТ-азной активностью 37,0 едЦгА/см3
На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, фи-зиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий а-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paembacillus macerans 1024
В результате изучения физиолого-биохимических особенностей штамма Paembacillus macerans 1024 определены оптимальный состав питательной среды и условия культивирования для максимального накопления в культу-ральной жидкости а-ЦГТ-азы.
На основании определенных ранее зависимостей накопления а-ЦГТ-азы Paembacillus macerans 1АМБ в культуральной жидкости и выявления условий сохранения ее активности от параметров всех процессов разработана технологическая схема получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы степени очистки Г20Х
Изучены свойства а-ЦГТ-азы (термостабильность, рН-стабилыюсть, температурный и рН-оптимумы действия, аминокислотный состав белка, его молекулярная масса)
В результате изучения поведения различных видов крахмалов в процессе обработки химическими, физическими и ферментативными методами усовершенствована биотехнология а-ЦД
На основании установленных параметров процессов включения различных веществ в полость а-ЦД разработаны условия получения комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина и их применения в технологии кондитерских изделий
Практическая значимость и реализация результатов работы.
Расширена лабораторная коллекция кафедры «Биотехнология» МГУПП, за
счет новых микроорганизмов секретирующих а-, |3- и у-специфичные ЦГТ-азы
Выделен новый термостабильный штамм продуцент а-ЦГТ-азы Paembacillus mac
erans 1024 Для нового штамма оптимизированы условия процесса культивирования
Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г10Х и проект Техни
ческих условий на ферментный препарат а-ЦГТ-аза Г10Х Осуществлена нара
ботка препаратов а-ЦГТ-аз Г10Х в условиях опытного производства НТЦ «Лекбио-
тех» Полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех»
Разработана технология получения ферментного препарата а-ЦГТ-азы Г20Х с использованием ранее выделенного штамма Paembacillus macerans 1АМБ Разработаны Лабораторный регламент получения а-ЦГТ-азы Г20Х и проект Технических
условий на ферментный препарат а-ЦГТ-аза Г20Х Осуществлена наработка препаратов а-ЦГТ-аз Г20Х в условиях опытных производств НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш» Полученные результаты подтверждены актами НТЦ «Лекбиотех» и ОАО «Биохиммаш». Усовершенствована биотехнология а-ЦД, составлен проект Технических условий на а-ЦД, произведена наработка препарата а-ЦД в условиях опытного производства НТЦ «Лекбиотех» (полученные результаты подтверждены актом НТЦ «Лекбиотех»)
Получены опытные партии комплексов включений а-ЦД с кристаллическим ванилином и эфирным маслом апельсина, прошедшие апробацию при изготовлении помадных конфет на кафедре «Технология кондитерского производства» МГУПП Полученные результаты подтверждены актом о приготовлении кондитерских изделий с добавлением в рецептуры комплексов включений
Штамм бактерий Paenibacillus macerans 1АМБ - продуцент а-ЦГТ-азы, защищен патентом РФ № 2303062
Проведен расчет экономической эффективности разработанных технологий а-ЦГТ-азы Г20Х и а-ЦД, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 1039,1 рублей за 1 кг Цена а-ЦД при этом составляет 656,6 рублей за 1 кг.
Апробация работы.
Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2005), на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006), V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007), на Международной научно-практической конференции «Биотехнология Вода и пищевые продукты» в рамках московского международного конгресса «Биотехнология- состояние и перспективы развития» (Москва, 2008)
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 1 патент РФ, где отражены основные положения диссертации Структура н объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 208 наименований, 13 при-
ложений Работа изложена на 221 странице компьютерного текста, включает 56 рисунков и 42 таблицы
Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН
Алкалофильные бациллы - продуценты ЦГТ-азы, известные с начала 7,0-х годов прошлого столетия, впервые были выделены японским микробиологом Хорикоши, их открытие послужило отправной точкой для организации масштабных технологических процессов получения р-ЦД по типу неконтролируемой конверсии. В большинстве случаев алкалофильные бациллы являются носителями генов р-ЦГТ-азы.
Обсуждаемые разновидности бацилл циклодекстриногенов таксономически весьма гетерогенны и об этом свидетельствует спектр названий, использованных для обозначения штаммов-продуцентов [18,20,26].
Описаны и частично охарактеризованы алкалофильные и алкалотолерантные культуры, обозначенные как B.circulans var. alkalophilus, B.firmus alkalophilus , B.firmus lentus 290-3; B.lentus, и B.agaradhaerens [172,184,194].
Культивирование алкалофильных и алкалотолерантных бацилл осуществляют в ферментерах в условиях активной аэрации, при этом используются щелочные питательные среды разнообразного состава (рН 9,0-10,0), содержащие в своем составе карбонат натрия [163,170,178]. Продуценты ЦГТ-азы, развивающиеся при нормальных значениях рН.
Среди нормофильных (развивающихся при нейтральных значениях рН) бацилл с циклодекстриногенной активностью, могут быть упомянуты лишь единичные культуры, идентифицированные авторами в качестве B.subtilis 313; B.coagulans YH-1306; B.ohbensis sp. nov. C-1400; B.megaterium FERM P-935, B.amyloliquefaciens AL35; B.autoliticus FERMP-10901 [76,93,98]. Авторы работ приводят весьма обобщенные сведения по физиолого-биохимической идентификации перечисленных культур, в связи с чем, некоторые из перечисленных названий вызывают сомнения.
С большей степенью уверенности можно говорить лишь о том, что они входят в порядок Bacillales. Термотолерантные циклодекстриногены.
В попытках выделить продуцентов ЦГТ-аз, обладающих высокой термостабильностью, были изучены культуры, обозначенные авторами в качестве B.stearothermophilus ИНМИА-3849; B.stearothermophilus SE-4; B.stearothermophilus ТС-91 [7,130,153].
Культуры развивались при температурах 60С на средах относительно небогатого состава, в аэробных условиях и, по данным авторов, секретировали ЦГТ-азы с термостабильностью Топт=65-80С, Это были как Р-ЦГТ-азы, так и ферменты со смешанной специфичностью (а+р-ЦГТ-азы), катализировавшие синтез примерно равных пропорций а и Р-ЦД. В 2001 году представители B.stearothermophilus были отнесены к роду Geobacillus.
К порядку Bacillales (семейство Thermoactinomycetaceae) относятся, по всей видимости, штаммы, выделенные в 1995 году В.А. Абеляном и обозначенные Thermoactinomyces sp., (штаммы ИНМИА-А561 и А554). ЦГТ-азы перечисленных культур проявляли высокую стабильность в интервале рН 5,5-8,5, а максимальную циклизующую и декстриногенную активность при рН 6,0-7,0 при температурах ниже 55-60.
Другой штамм Thermoactinomyces thermosulfurigenses EMI был выделен Wind с соавторами также в 1995 году [203]. Продуценты ЦГТ-аз. не относящиеся к порядку Bacillales. Прежде всего, в обозначенную группу следует занести два штамма Klebsiella (порядок Enterobacterial семейство Enter obacteriaceae). Наибольшее распространение получил штамм условно патогенных энтеробактерий Klebsiella pneumoniae M5al, синтезирующих внеклеточную а-ЦГТ-азу.
Продуцент - малоподвижные палочки со слизистой капсулой, относится к разряду факультативных анаэробов, развивающихся при температуре 28С,_ рН 6,5, имеющих грамотрицательное строение клеточной стенки. Другая культура циклодекстриногенов, K.oxytoca 19-1, была выделена Lee с соавторами в 1992. Практического значения продуценты Klebsiella не имеют вследствие условной патогенности самих микроорганизмов и низкой температурной стабильности фермента (до 40С) [122].
Среди малоизученных штаммов с циклодекстриногенной активностью следует назвать единичные изоляты Micrococcus varians и Micrococcus luteus, выделенные Yagi в 1982. Культуры были представлены неподвижными сферическими клетками, не образующими спор, анаэробно развивающимися при рН 6,8-8,5, Т= 25-37С.
Существенный практический и теоретический интерес представляют сообщения об обнаружении единичных циклодекстриногенных культур среди бревибактерий Brevibacterium sp. 9605 Mori et. al., 1994, облигатных анаэробов Clostridium thermohydroamylolyticum ATCC 39252, ATCC 53016, архей-гипертермофилов Thermococus sp. B001 Tachibana et. ah, 1999, псевдомонад Pseudomonas species NRRL B-18375 [198].
Крахмал, используемый для циклизации
Общий смысл этой процедуры заключается в том, что к подогретому водному раствору ЦД постепенно добавляют «вещество — гость» или его раствор в полярном растворителе, например этиловом спирте, ацетоне. Дополнительный растворитель применятся в том случае, если вещество-гость имеет твердое агрегатное состояние. Чисто внешне, поведение системы может быть описано тремя схемами:
В зависимости от того, каков характер комплексообразования, выбирается методическая стратегия, заключающаяся в правильном подборе времени реакции и физических условий ее проведения. В идеале, ее следует провести таким образом, чтобы добавленные порции комплексообразователя успевали образовать соединение включения до выпадения кристаллического осадка, после чего снизить температуру и добиться его образования. С этой точки зрения варианты схем 1 и 2 являются более благоприятными в плане прогноза качества будущего комплекса. При «быстрой» кристаллизации комплекса получаемого из твердофазного соединения следует остерегаться образования смеси кристаллов комплекса с исходным «гостем» [79].
Процесс; образования1 комплексов, включений осуществляют ; при интенсивном перемешивании. Чем выше степень, гидрофобности субстанции, которая должна быть переведена в комплекс, или чем значительнее плотность, ее отличается от плотности воды, тем активнее перемешивают реакционную смесь. В; некоторых случаях идеальными можно: считать ультразвуковые перемешивающиеустройства. : Температуру раствора подбирают, исходя из целесообразности повышения.начальной5концентрации реакционных ингредиентов, (например-(3-ЦД, растворимость которого; ограничена); или: с: целью; замедления реакции комплексообразования (диссоциация комплекса в- воде особенно активна. при температурах выше 50-709G)i
Скорость подачи? комплексообразователя ограничивают в, случае;, если комплексант сильно гидрофобещ чтобы избежать расслоения; системы.; Ее также ограничивают, при высокой температуре.. ; ;
Величина кислотности- (щелочности)? раствора имеет- важное значение, когда комплексообразователь ионизирован. Подбирают такие значения рЩ когда ионизация отсутствует - то есть с органическими? кислотами работать в: кислых растворах, с аминами в щелочных.
Комплексообразование заканчивается в течение 2-24 ч. Контроль за процессом осуществляют даже визуально - путем микроскопирования: специфические кристаллы ЦД исчезают и их заменяет аморфоподобная высокодисперсная масса: Факт кристаллообразования может быть подтвержден также методами рентгеноструктурного анализа. Считается, что для получения комплексов включения в промышленных условиях суспензионным метод является наиболее удобным [78]. ;
Уникальное свойство ЦД образовывать комплексы включения с молекулами самых разнообразных веществ обусловливает огромный;научный и практический интерес к этим соединениям. Они находят широкое применение в пищевой и косметической промышленности, медицине и сельском хозяйстве.
Тот факт, что ЦД являются продуктами ферментативно модифицированного крахмала, открывает широкие возможности их применения в пищевой промышленности, в первую очередь для улучшения потребительских качеств продуктов: повышения пищевой ценности, улучшения» органолептических качеств, реологических свойств, увеличения срока хранения.
Чаще всего ЦД применяют как пищевые добавки. В экспериментах на животных при кормлении препаратами ЦД, меченых 14С, показано, что ЦД практически полностью усваиваются в организме, и это указывает на , их пищевую ценность. Имеются даже данные о том, что ЦД как пищевые добавки регулируют обмен липидов и понижают уровень холестерина в организме. Разрешение на использование ЦД: в пищевой промышленности в качестве добавок к пищевым продуктам имеется во многих странах, в том числе во Франции, Нидерландах, Бельгии и др. [41,100,112].
Вещества, определяющие вкус и аромат пищи, часто не очень стабильны и разлагаются, поэтому, комплексообразование с ЦД приводит к стабилизации ароматических веществ и специй. Изготовление таких комплексов ароматических веществ с ЦД решает многие вопросы технологии приготовления приправ, их хранения, составления диет, санитарии и т.п. Сухие концентраты комплексов ЦД с пищевыми компонентами достаточно стабильны и в водной среде диссоциируют.
Определение содержания влаги в образцах навесок исследуемого вещества
На колонку (1x1,5 см) с а-ЦД сефарозой 4В, предварительно, уравновешенную 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 6,6, наносили 20 см3 КЖ в этом же буфере со скоростью 20 см /ч. После нанесения и промывки уравновешивающим буфером, сорбированную ЦГТ-азу элюировали 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 6,6, с 0,25 М NaCl и 5 мМ а-ЦД. Определение ЦД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяет осуществить быстрое разделение продуктов реакции, в том числе ЦД, образующихся под действием ЦГТ-аз. Он основан на различии в равновесном распределении образца между подвижной и неподвижной фазами.
При элютивном режиме компоненты образца вводятся в хроматографическую систему и вымываются соответственно их распределению между стационарной и подвижной фазами. ВЭЖХ позволяет использовать « малые количества образца, при этом достигается высокая эффективность и точность анализа. . і Для ВЭЖХ анализа ферментолизатов крахмала на содержание использовали колонку «МН2-диасфер» со средним диаметром частиц 5 мкм, размером 4,6; х 250 мм. Неподвижная фаза - с размерами частиц 5,1 мкм; подвижная фаза - ацетонитрил : бидистиллированная вода (70:30); объем вводимой пробы - 80 мкл; скорость элюции - 0,8 см-/мин.; скорость ленты 7 10 см/час. В качестве детектора использовали- дифференциальный рефрактометр. Регистрацию аналогового сигнала и вычислительную обработку хроматограмм проводили с помощью программно.вычислительного комплекса «МультиХром ГПХ» фирмы Ampersand (Центр «Биоинженерия» РАН). Подготовка пробы: 2 см субстрата (3%-ный крахмал в ацетатном буфере рН 6,2) инкубировали с 1 см ферментного раствора, в течение 24 ч при 40С. Ферментативную реакцию останавливали добавлением равного объема ацетонитрила, осадок удаляли центрифугированием в течение 5 мин при Г3400 об/мин. Обработка результатов:
Идентификацию компонентов исследуемой смеси проводили по времени удерживания. Значения времени удерживания а-, (3- и у-ЦД определяли путем анализа стандартной смеси. Концентрация стандартных растворов ЦД - 1 г/дм3.
Концентрации ЦД, образовавшихся после проведения ферментативной реакции, рассчитывали, сопоставляя величины показаний абсолютного изменения дифференциального рефрактометра с калибровочными значениями. ї
Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта Г16.221. Состав питательных сред является важнейшим средством оптимизации микробиологических процессов. Подбор- ферментационных сред обычно выполняется путем длительных экспериментов. I
Оптимизацию состава питательной среды для глубинного культивирования Paenibacillus macerans 1024 проводили с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Аддитивно - решетчатое описание является не точной моделью объекта, а его приближенной аппроксимацией. Но если оно построено по всему рабочему диапазону изменения факторов, то позволяет на первых этапах изучения процесса "нащупать" область, близкую к оптимуму. В зависимости от степени детализации околооптимальной области целесообразно использовать-аддитивно - решетчатые описания с числомуровней факторов 3 — 6.
Факторами, влияющими на эффективность биосинтеза ( а-ЦГТ-азы культурой Paenibacillus macerans 1024, являются концентрации в питательной среде крахмала, пептона, (NH HPO дрожжевого и кукурузного экстрактов и декстринов.
Уровни изучаемых факторов представлены в табл.6 и выражены в % от объема питательной среды. Матрица, составленная с учетом изменения уровней изучаемых факторов, и результаты реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта приведены в табл.7.
Оптимизация состава питательной среды с использованием метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта
Для очистки и концентрирования культуральной жидкости продуцента Paenibacillus macerans ГАМБ методом ультрафильтрации были испытаны ацетатцеллюлозные мембраны типа УПМ (фирмы «Владипор») с различной селективностью.
Анализ литературных данных показал, что величина молекулярной массы ЦГТ-азы зависит от продуцента и находится в пределах Предварительно отцентрифугированную- культуральную жидкость, подвергали очистке и концентрированию на ультрафильтрационной" установке (Р=0,35 МПа, t= 20±1С) с мембраной УПМ-67, задерживающей белки с молекулярной массой более 67 кДа. По окончании процесса, ультраконцентрат лиофильно высушивали на установке «Crist Alpha 1-2» (НТЦ «Лекбиотех») и использовали для определения а-ЦГТ-азной активности. Результаты исследований представлены в табл. 17.
Достигнутая степень концентрирования по объему т=12,3. Выход препарата а-ЦГТ-азы составил 1,25 г/дм .
При испытании мембраны УПМ-67, активность ЦГТ-азы распределилась, причем максимум ее наблюдался в ультрафильтрате, следовательно, использование мембраны с таким размером пор не целесообразно.
Далее испытывалась мембрана УПМ-50, задерживающая белки с молекулярной массой более 50 кДа. Результаты исследований представлены в табл. 18. Достигнутая степень концентрирования по объему т=11,5. Выход препарата а-ЦГТ-азы составил 0,68 г/дм3.
Основными критериями выбора ультрафильтрационных мембран являются отсутствие ферментативной активности в фильтрате и высокая скорость фильтрации раствора. Поскольку в ультрафильтрате культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ обнаружена ферментативная активность а-ЦГТ-азы, мембрану марки УПМ-50 не целесообразно использовать для концентрирования этого фермента.
Далее изучали возможность концентрирования ЦГТ-азы на ультрафильтрационной установке с мембраной УПМ-20, задерживающей белки с молекулярной массой более 20 кДа. Полученные данные представлены в табл. 19.
Достигнутая степень концентрирования по объему т=5,9 (дальнейшее увеличение степени концентрирования привело к резкому снижению скорости фильтрации).
Из анализа данных табл. 17-20 следует, что для концентрирования и очистки ЦГТ-азы методом ультрафильтрации целесообразно использовать мембрану марки УПМ-20. При этом активность ЦГТ-азы в ультрафильтрате наименьшая и составляет 0,76 едЦгА/см что соответствует допустимым нормам.
Изучение возможности использования мембран с меньшей пропускающей способностью представлялось нецелесообразным, так как из-за маленького размера пор скорость процесса была бы сильно снижена.
Таким образом, в дальнейшем для концентрирования культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ целесообразно применять мембрану УПМ-20.
Важной характеристикой процесса ультрафильтрации является его скорость, зависящая от рабочего давления, концентрации раствора, степени его очистки и т.д.
Для изучения влияния давления на скорость улитрафильтрации, концентрирование культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ осуществляли при различных рабочих давлениях (0,2-0,6 МПа), кратность концентрирования по объему т=5. Результаты исследований представлены на рис.21.
При увеличении давления до 0,35 МПа, скорость ультрафильтрации, или удельная производительность мембраны, росла пропорционально рабочему давлению. При достижении значения рабочего давления 0,35 МПа и более скорость ультрафильтрации не изменялась. Подобная зависимость объясняется явлением концентрационной поляризации, заключающейся в увеличении концентрации растворенного вещества у поверхности мембраны в процессе переноса растворителя через мембрану.
Таким образом, оптимальным рабочим давлением для дальнейших экспериментов было выбрано давление 0,35 МПа.
Процесс ультрафильтрации может применяться при« концентрировании растворов ферментов в широком диапазоне значений коэффициента уменьшения объема (Kv = 200). При различных степенях концентрирования. существенно различаются качественные показатели- (концентрация и степень очистки фермента), а также физико-химические свойства концентратов.
Помимо этого, от степени концентрирования зависят и технологические показатели процесса ультрафильтрации - общий выход, фермента, скорость фильтрации или удельная производительность и т.д.. Концентрирование культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ проводили до коэффициента извлечения пермеата равного? 0,93, что! соответствовало 15-кратному уменьшению исходного объема. Процесс проводили на лабораторной ультрафильтрационной установке «Amicon Ni 2000» с применением мембраны УПМ-20 при рабочем, давлении 0,35 МПа и температуре 20±1С.
Итак, содержание сухих веществ (СВ) в ультраконцентрате непрерывно росло (рис.22, табл. 21), причем особенно быстро после достижения m = 5, а скорость фильтрации, или удельная производительность мембраны, все время уменьшалась, и особенно резко после m = 5. Причина снижения производительности, скорее всего, заключается в концентрационной поляризации: при повышенных концентрациях белковых растворов начинается гелеобразование на поверхности мембраны, возрастает вязкость раствора, которая обратно пропорциональна потоку пермеата.
