Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Наумышева, Елена Борисовна

Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ
<
Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Наумышева, Елена Борисовна. Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.21 / Наумышева Елена Борисовна; [Место защиты: С.-Петерб. гос. ун-т].- Санкт-Петербург, 2013.- 139 с.: ил. РГБ ОД, 61 13-2/178

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Литературный обзор 10

1.1 Адресная доставка лекарственных препаратов 10

1.2 Синтез химически модифицированных кремнеземов 19

1.3 Матрицы для иммобилизации ферментов 27

1.4 Твердофазный синтез пептидов

1.4.1 Полимерные носители для твердофазного синтеза 36

1.4.2 Кремнеземные матрицы для твердофазного синтеза

Экспериментальная часть 50

Глава 2. Характеристика реагентов и методы анализа продуктов

2.1 Определение величины удельной поверхности 54

2.2 Определение содержания аминогрупп на поверхности твердых тел

2.3 Определение содержания флуоресцеина, Zn-протопрофирина, кардиогрина и 3-(Вос-амино)октановой кислоты на поверхности кремнезема

2.4 Определение содержания брадикинина 62

2.5 Определение содержания аденозина 62

2.6 Определение содержания глицина на поверхности неорганических матриц

2.7 Анализ на углерод 64

2.8 Определение содержания фуллеренов 65

2.9 Определение содержания карбоксильных групп

2.10 ИК-Фурье спектроскопия диффузного отражения 66

2.11 Тонкослойная хроматография 66

2.12 Элементный анализ

Глава 3. Модифицирование поверхности аэросила и иммобилизация биологически активных веществ

3.1 Синтез аминированного кремнезема 68

3.2 Иммобилизация Zn-протопорфирина и флуоресцеина на аминированный аэросил

3.3 Синтез спейсера 74

3.4 Иммобилизация Zn-протопорфирина и флуоресцеина на аэросил с, привитым спейсером

3.5 Присоединение янтарного ангидрида к поверхности аминированного аэросила

3.6 Присоединение глутарового диальдегида к поверхности аминированного аэросила

3.7 Иммобилизация брадикинина глутаральдегидным методом 80

3.8 Сорбция аденозина 80

3.9 Десорбция аденозина

3.10 Адсорбционная иммобилизация кардиогрина 84

3.11 Исследование образцов модифицированного аэросила 85 методом ИК-Фурье спектроскопии диффузного отражения

3.12 Исследование Zn-протопорфиринсодержащего кремнезема 89 методом электронной спектроскопии диффузного отражения

Глава 4. Синтез матрицы для получения пептидов 91

4.1 Синтез модификаторов 91

4.1.1 Методика синтеза 2-фенилэтилтрихлорсилана 91

4.1.2 Получение хлорметилметилового эфира

4.2 Модифицирование поверхности кремнезема фенилэтилсилильными группами

4.3 Хлорметилирование привитых фенилэтилсилильных групп 97

4.4 Иммобилизация п-гидроксибензилового спирта 99

4.5 Присоединение Fmoc-аминокислот и синтез глицил-глицина 101

4.5.1 Присоединение глицина 102

4.5.2 Синтез глицилглицина

4.6 Синтез кремнеземов с привитыми пиренильными группами и исследование их хроматографических свойств

4.7 Исследование модифицированных кремнезёмов методом ИК- Фурье спектроскопии диффузного отражения

Заключение 116

Выводы 117

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы. В настоящее время остро стоят проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, при этом их доля среди причин смертности составляет около 57% и эта цифра имеет тенденцию к росту. Лекарственные препараты, применяемые для лечения ишемии, зачастую имеют серьезные побочные действия, помимо этого, для достижения терапевтического эффекта необходимо создать очень высокую концентрацию их во всем организме. Решить данную проблему можно с помощью систем адресной доставки лекарственных препаратов наноносителями непосредственно к поврежденным органам и тканям. Таким образом, появляется возможность не только обеспечить действующую и довольно высокую концентрацию препаратов в зоне ишемии, но и снизить побочные эффекты, связанные с системным влиянием лекарств и их воздействием на интактные ткани. Кроме того, иммобилизация биологически активных веществ на носителях позволяет повысить растворимость и стабильность препаратов, улучшить их биосовместимость, обеспечить контролируемое и пролонгированное высвобождение препарата из материала носителя.

Среди возможных носителей нанодисперсные кремнеземы обладают следующими преимуществами: они нетоксичны и биологически совместимы; способны к биодеградации в среде живых организмов; существует возможность варьирования размеров частиц; большая удельная поверхность аэросила позволяет получать препараты с высоким содержанием биологически активных веществ; химия поверхности дисперсного кремнезема обеспечивает создание активных центров различной природы для иммобилизации лекарственных препаратов.

Последнее свойство широко используется для разработки методик синтеза разнообразных по своему строению и химическим свойствам функциональных групп на поверхности кремнезема, служащих для присоединения биологически активных веществ, их удержания и высвобождения с необходимой для эффективного терапевтического действия скоростью. Созданные подобным образом материалы получили общее название - химически модифицированные кремнезёмы (ХМК). В настоящее время актуальной задачей является получение носителей – так называемых матриц – именно на основе ХМК, применяемых наряду с традиционно используемыми функционализированными полимерами для синтеза биологически активных соединений, их иммобилизации, а в случае лекарственных препаратов – для доставки к очагу заболевания. Помимо описанных выше преимуществ, ХМК выгодно отличаются от полимерных носителей своими физико-механическими свойствами, размерной стабильностью, химической устойчивостью к действию большинства растворителей, что в совокупности позволяет использовать широкий спектр синтетических подходов, включая метод химической сборки, основанный на многостадийном синтезе с участием органических групп, привитых к поверхности кремнезема.

Цель работы - разработка методик синтеза нанодисперсных кремнеземных матриц с использованием метода химической сборки, предназначенных для иммобилизации биологически активных веществ (в том числе пептидов) и маркерных соединений, позволяющих фиксировать распределение наночастиц в живом организме, исследование возможности применения полученных носителей для адресной доставки препаратов, обладающих кардиопротективным действием, а также получение кремнеземных матриц для пептидного синтеза и сорбентов для разделения фуллеренов.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

Синтез на поверхности носителя молекул-спейсеров, отвечающих за присоединение биологически активных веществ и маркерных соединений, позволяющих фиксировать распределение наночастиц в живом организме;

Изучение состава, строения и свойств закрепленных на аэросиле поверхностных соединений, являющихся активными центрами для иммобилизации биологически активных веществ;

Получение на поверхности нанодисперсного кремнезема привитых функциональных групп, обеспечивающих иммобилизацию кардиопротекторов (аденозин, брадикинин), маркерных соединений (флуоресцеин, кардиогин), противоракового препарата (Zn-протопорфирин);

Изучение биосовместимости и способности к биодеградации полученных матриц;

Модифицирование поверхности кремнеземов методом химической сборки с целью создания матриц для синтеза пептидов;

Синтез сорбента с привитыми пиренильными группами для хроматографического разделения фуллеренов С60, С70.

Научная новизна:

  1. Разработаны с использованием метода химической сборки новые методики синтеза нанодисперсных кремнеземных носителей на основе аэросила, предназначенных для иммобилизации и адресной доставки кардиопротекторов, а также маркерных соединений, позволяющих фиксировать распределение наночастиц кремнезема (НЧК) в живом организме.

  2. Получены носители на основе аэросила с привитыми функциональными группами различного строения, обеспечивающими пролонгированное высвобождение лекарственного препарата аденозина.

  3. Методом химической сборки получена кремнеземная матрица для твёрдофазного пептидного синтеза, содержащая п-гидроксибензильные группы и исследована возможность ее применения при получении модельного дипептида глицилглицина.

  4. Предложен новый способ получения эффективных сорбентов, содержащих пиренильную группу, предназначенных для хроматографического разделения фуллеренов С60, С70.

Практическая значимость. Практическое значение исследования связано с тем, что разработанные синтетические методики получения носителей биологически активных веществ позволяют создать препараты для целенаправленного воздействия на очаговые заболевания (ишемии и раковые опухоли), обеспечивая локальное увеличение концентрации и таргетное воздействие лекарственного препарата на поврежденный участок, что уменьшает негативное воздействие медикамента на организм в целом.

Кроме того, иммобилизация малорастворимых в воде препаратов на гидрофильных кремнеземных нанодисперсных частицах способствует их легкому введению в биологические системы без угрозы нарушения гемодинамики, а также предотвращает чрезмерно быстрое их распространение в тканях и жидкостях организма, что является отличительной чертой препаратов с пролонгированным действием.

Значительным достоинством кремнеземной матрицы для твёрдофазного пептидного синтеза является возможность отделения целевого продукта – полипептида – под действием мягких кислотных реагентов, что исключает риск повреждения химически уязвимой полипептидной секвенции.

Разработанный способ синтеза сорбентов для хроматографического разделения фуллеренов С60, С70 в отличие от известных методов получения сорбентов, содержащих пиренильные группы, не предполагает использования сложных дорогостоящих модификаторов, что определяет перспективность его использования для углеродных нанотехнологий.

Основные положения, выносимые на защиту:

Способ получения нанодисперсных кремнеземных носителей для кардиопротекторов и маркерных соединений методом химической сборки.

Методика получения кремнеземных матриц для твердофазного синтеза пептидов, обеспечивающая отделение целевого продукта под действием мягких кислотных реагентов.

Способ получения сорбента с привитыми пиренильными группами, предназначенного для хроматографического разделения фуллеренов С60, С70.

Личный вклад автора. Основная часть работы, изложенная в диссертации, выполнена автором самостоятельно. Она включает в себя общее планирование работы, разработку методик синтеза, получение и интерпретацию экспериментальных данных, формулировку цели, задач, выводов данной работы, написание и публикацию статей.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XXII симпозиуме «Современная химическая физика» (г. Туапсе, 2010), Молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы органической химии» (Новосибирск, 2010), Международной конференции по химии "Основные тенденции развития химии в начале XXI-го века" (С-Петербург, 2010), IV международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2010), Международной конференции «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (С-Петербург, 2009), Четвертой Всероссийской конференции с международным участием «Химия поверхности и нанотехнология» (Санкт-Петербург-Хилово, 2009), V Всероссийской научной конференции по химии студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире» (С-Петербург, 2011), Международной конференции «Приоритетные направления научных исследований нанообъектов искусственного и природного происхождения» (С-Петербург, 2011), Всероссийской научной школе по аналитической химии (Краснодар, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (С-Петербург, 2012)

Публикации. По материалам исследования опубликовано 8 статей (в российских и международных журналах) и 13 тезисов. Результаты работы были представлены в 13 докладах на международных и российских конференциях, а также получен патент РФ на изобретение «Способ кардиопротекции» (RU 2456024 C2 от 26.04.2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 139 страницах печатного текста. Список цитируемой литературы включает 132 наименования. Работа состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4), заключения, выводов и приложения. В экспериментальной части описаны методики проведения экспериментов по синтезу матриц для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ. Приложение содержит данные биологических исследований полученных носителей. Завершают работу выводы и список цитируемой литературы. Диссертация содержит 44 рисунка и 25 таблиц.

Матрицы для иммобилизации ферментов

Липосомы для доставки противоопухолевых лекарств были впервые предложены Gregoriadis и соавт. [14] в 1974 г. и с тех пор некоторые лекарственные препараты на их основе уже вошли в клиническую практику [15]. Липосомы представляют собой сферические пузырьки, состоящие из фосфолипидов, которые имеют гидрофильную и гидрофобную части (рис. 1.7). Для предотвращения захвата ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) чужеродных веществ (в данном случае липосом) в липидный бислой часто вводят полиэтиленгликоль (ПЭГ), который защищает липосомы от захвата мононуклеарами [16]. Такие частицы могут долгое время циркулировать в кровеносной системе не разрушаясь, однако имеют существенный недостаток -плохо накапливаются в опухоли. Для преодоления этого недостатка были разработаны так называемые иммунолипосомы, к которым прикреплены моноклональные антитела (МКА), которые обеспечивают специфическое связывание с антиген-позитивными клетками, тем самым, доставляя лекарственные препараты непосредственно к поврежденным тканям. В качестве фосфолипидов чаще используются продукты животного происхождения (фосфатидилхолин из яичного желтка, подкожный жир морских тюленей, якутских лошадей и т.д.), которые характеризуются высокой органотропностью.

Для модифицирования поверхности липосом с целью обеспечить их адресную доставку и преодоления РЭС, в основном используется 5 типов реакций: 1) реакция между малеинимидными производными и тиолами, в результате которой формируются тиоэфирные связи; 2) реакция между пиридилдитиолами и тиолами, в результате чего образуются дисульфидные связи; 3) реакция между активированными карбоксильными группами и аминогруппами, в результате которой образуется амидная связь [17]; 4) образование карбаматной связи посредством реакции между п-нитрофенилкарбонильной и аминогруппой [18]; 5) возможно использование нековалентного связывания через образование комплекса биотин-авидин/стрептавидин [17, 19].

Для контролируемого высвобождения лекарственного препарата возможно применение термо- или ph-чувствительных липосом, имеющих довольно прочную мембрану при нормальных (физиологических) условиях, но при понижении ph среды или повышении температуры, которые свойственны определенным патологическим процессам или создаются искусственно, проницаемость мембран увеличивается [20].

Использование магнитных липосом позволяет управлять их распределением в организме посредством внешнего магнитного поля, снижая негативное воздействие на здоровые ткани. В качестве ферромагнетиков чаще используют наноразмерные порошки железа, кобальта, никеля, гидроксиды и оксиды железа. Для предотвращения взаимодействия ферромагнетиков с внутренней средой организма, возможно их покрытие пироуглероднои оболочкой [21].

Работы по созданию различных магнитных систем для адресной доставки лекарственных веществ ведутся по трем основным направлениям [22]: инкапсулирование ферромагнетиков и лекарств в различные «оболочки» [23]; формирование полимерной оболочки на поверхности магнетита, на которую проводится иммбилизацию биологически активных веществ [24]; непосредственное закрепление препаратов на поверхности магнитного носителя [25].

Еще одним способом увеличения терапевтического эффекта и снижения негативного влияния лекарственных веществ, является закрепление их на поверхности носителя. Иммобилизация, проведенная таким путём, позволяет обеспечить пролонгированное действие препарата,, уменьшить дозу и снизить его побочные эффекты, увеличить стабильность лекарств при хранении [26]. При этом носители должны обладать рядом свойств: быть нетоксичными и биосовместимыми, иметь определенную структуру и размеры, чтобы проникать сквозь клеточные мембраны, обладать определенной динамикой сорбции/десорбции и доставлять лекарственные препараты без потери их фармакологических качеств [27].

В качестве носителей представляет интерес использование наночастиц исходной и модифицированной целлюлозы [26], нанодисперсных кремнеземов [27], в том числе аэросила [28]. В работе [27] для получения закрепленного на твёрдотельной фазе иммуноглобулина овцы, снабженного флуоресцирующей меткой, поверхность кремнезема была предварительно аминирована 3-аминопропилтриэтоксисиланом золь-гель методом. Исследование показало, что в процессе иммобилизации не происходит денатурация и снижение физиологической активности белка.

Наночастицы аэросила использовались в работе [28] для иммобилизации фуллерена, который возможно использовать в фотодинамической онкотерапии благодаря его способности генерировать активные формы кислорода. По причине того, что фуллерены обладают гидрофобным характером, их введение в биологическую среду весьма затруднительно, однако иммобилизация его на гидрофильные частицы аминоаэросила позволяет использовать фуллерен в качестве лекарственного препарата. При изучении цитотоксичности полученных фуллеренсодержащих нанокомпозитов, было доказано, что без облучения они не влияют на жизнедеятельность клеток, но при облучении видимым или ультрафиолетовым светом деструкция клеток повышается, причем в большей степени это касается раковых клеток [29].

В исследованиях Жирова А.А и соавт. для доставки мет-энкефалина в головной мозг использовались носители на основе гидрозоля наночастиц SiC 2, после ультразвуковой обработки кремнезема и сорбции лекарственного препарата [30]. За счет небольшого диаметра частиц 6-10 нм обеспечивалось прохождение лекарственного вещества через гематоэнцефалический барьер с последующим пролонгированным высвобождением медикамента за время присутствия комплекса носитель+лекарство в организме, так как органами ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) поглощаются преимущественно частицы диаметром более ЮОнм.

В работе [31] исследовалась возможность получения осажденного силикагеля с активным материалом, но недостатком этого метода являлись получающиеся довольно крупные частицы диаметром около 1 мкм.

На наш взгляд, высокодисперсные кремнеземы являются перспективными носителями лекарственных препаратов, но для их эффективного использования необходимо провести химическое модифицирование поверхности матриц.

Определение содержания флуоресцеина, Zn-протопрофирина, кардиогрина и 3-(Вос-амино)октановой кислоты на поверхности кремнезема

Рассмотренные методики твердофазного синтеза, несмотря на кажущиеся различия, построены всё же на стратегии Меррифильда и в них заложено соблюдение основных последовательностей метода, чередования стадий и подбора реагентов, а в качестве матрицы используется полимерная конструкция, химически модифицированная под условия конкретного эксперимента с учётом свойств ожидаемого продукта.

Однако применение таких классических носителей оказалось ограниченным вследствие их набухаемости, степень которой может существенно варьироваться в случаях применения различных растворителей. Подобная размерная нестабильность способна привести к проблеме транспорта реагентов к поверхности матрицы, затрудненному удалению продуктов, кроме того, органические смолы не всегда обладают достаточной химической инертностью по отношению к реагентам, использующимся в последовательности реакций получения биологически активных соединений.

Подобные трудности синтеза на твёрдой фазе возможно решить, используя в качестве матрицы - химически модифицированные кремнезёмы.

Ненабухаемость и химическая устойчивость делает этот материал ценной основой для проведения на его поверхности сложных процессов химической сборки и иммобилизации, включая методики, предусматривающие жесткое воздействие сильных кислот и растворителей.

Для получения химически модифицированных кремнезёмов весьма эффективно используются описанные выше методы поверхностной сборки и иммобилизации.

В работе Парра - Грохмана при получении матриц для пептидного синтеза была использована методика, основанная на модифицировании пористых стёкол кремнииорганическими реагентами, содержащими хлорметильные группы, используемые для присоединения первой аминокислоты [107, 108]: Модифицирование кремнезёмной матрицы авторы проводили методом иммобилизации.

Интересной идеей в области получения химически модифицированных кремнезёмов для твердофазного пептидного синтеза является разработка «летучих» носителей и, так называемых, «трейслес» линкеров (traceless linkers) для твердофазного синтеза органических соединений [109]. Подобный подход позволяет избежать обычного для классической схемы синтеза стадии сепарации отщеплённого от матрицы продукта путём фильтрации или центрифугирования. Суть его заключается в использовании в ходе синтеза твердых подложек, а также линкеров, которые могут быть полностью удалены путём их полного разложения и "улетучивания" во время заключительной стадии отщепления (Рис. 1.13).

Весьма интересен и тот факт, что в качестве подобного «летучего» носителя возможно использовать силикагель — один из наиболее традиционных и сравнительно недорогих материалов для твердофазного синтеза.

Общая концепция твердофазного органического синтеза с использованием «летучей» подложки и линкера [109] В начале образец силикагеля (Рис. 1.14: 1) функционализируется п-хлорметилфенилтриметоксисиланом (Рис. 1.14: 2) при нагревании в толуоле для получения необходимого для синтеза хлорметилбензил-силикагеля (Рис. 1.14: 3). Затем первая БОК-аминокислота в виде цезиевой соли в диметилформамиде соединяется с подложкой при нагревании до 55С (Рис. 1.14: 4). Далее возможно присоединение С- и N- защищенных аминокислот с деблокированием N-конца действием 50% раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане до получения необходимого полипептида (Рис. 1.14: 5).

На этой стадии силикагель вместе с хлорметилбензиловым линкером (Рис. 1.14: 5), связанным эфирной связью с пептидом, полностью разлагается действием 10% плавиковой кислоты (рН = 4,3) за 1 час при комнатной температуре. Это приводит к образованию С-защищенного полипептида, тетрафторсилана и воды (Рис. 1.14: 6). Последние побочные продукты и остатки растворителя легко удаляются в роторном испарителе или лиофилизацией (HF и тетрафторсилан легко улавливаются при продувании через линию, содержащую твёрдый СаО).

В реакционной ёмкости остается лишь основной продукт - полипептид, завершая синтез с отличными показателями чистоты и выхода продукта (93% -для гексапептидов, 81% - для ундекапептидов).

Недостатком этого метода является необходимость использования высокотоксичного фтористого водорода. SiJ-OH + O-Si

В работе [98] описывается синтез неорганических матриц на основе кремнезёма с различными якорными группами (рис. 1.15), которые позволяют отделять пептид под действием стандартных кислотных реагентов (НВг в трифторуксусной кислоте), а также путём переэтерификации и фотолиза. н2 н2 / \ н2 н2 н2 / \ н2

Присоединение янтарного ангидрида к поверхности аминированного аэросила

Проводилось изучение кинетики высвобождения аденозина (рис. 3.2), иммобилизованного каждым из трех способов - адсорбционном, ковалентном, ионном. 120 180 240 300 360

Образцы отмывали от избытка действующего вещества и высушивали при температуре 50-60С. Брали навеску и в центрифужной пробирке заливали раствором буфера Кребса-Хенслейта, близкого по составу к солевому составу крови (состав буфера: NaCl, NaHC03, КС1, КН2Р04, MgS(V7H20, СаС12, глюкоза безводная). Высвобождение действующего вещества проводили на перемешивающем устройстве LOIP LS ПО на 200 оборотах в минуту. Через определенные интервалы времени растворы центрифугировали и анализировали концентрацию десорбированного действующего вещества. С, мг/г

Рис. 3.2. Зависимость количества аденозина (С), перешедшего в раствор с поверхности наночастиц, отнесенного к единице веса от времени десорбции (t)

при различных способах иммобилизации: 1 - адсорбционном, 2 - ковалентном, 3 -ионном. Концентрацию действующего вещества в растворе буфера определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Shimadzu UV-mini 1240). Оптическую плотность регистрировали при длине волны А=260 нм (по методике, изложенной в главе 2.5).

Наиболее быстрое высвобождение препарата наблюдается при адсорбционной иммобилизации. Самое медленное - при ионном связывании. Данный факт может объясняться нестабильностью азометиновых групп [122] при связывании через глутаровый диальдегид.

В результате проведенного исследования было показано, что возможно обеспечение пролонгированности действия лекарственного препарата и подбор скорости десорбции можно проводить индивидуально для каждого случая.

Ещё одним веществом, применяемым для флуоресцентной диагностики опухолей, является кардиогрин. Проводили его иммобилизацию на аминированном аэросиле А-380. Для этого 1 мл водного раствора кардиогрина (0,5 мг) приливали к 50 мг аминированного аэросила А-380. Оставляли на сорбцию на 2 часа, затем промывали от избытка реагента водой и физиологическим раствором до отсутствия кардиогрина в промывных водах.

Содержание иммобизованного кардиогрина, определенное по методике, представленной выше, составило 0,01 ммоль/г.

Возможный механизм адсорбции обусловлен взаимодействием привитых аминогрупп поверхности кремнезема с сульфогруппами молекулы кардиогрина. Вероятный вклад в адсорбцию вносит дисперсионное взаимодействие между поверхностным слоем модифицированного кремнезема и довольно протяженными молекулами кардиогрина.

Полученный образец стабилен в условиях действия физиологического раствора, что и определило возможность его применения для определения биораспределения наночастиц. 3.11 Исследование образцов модифицированного кремнезема методом ИК-Фурье спектроскопии диффузного отражения

Для исследования полученных образцов использовали ИК-Фурье спектроскопию диффузного отражения по методике, изложенной в главе 2.10. Для снятия спектра использовались: аэросил А-380, аминированный аэросил А-380, аминированный аэросил А-380 с иммобилизованным флуоресцеином, аминированный аэросил А-380 с привитым спейсером, аминированный аэросил А-380 с иммобилизованным на спейсере протопорфирином. Спектры приведены на рисунках 3.3-3.7.

На спектре аэросила А-380 (рис. 3.3) имеются полосы поглощения 480, 810, 990, 1110, 1645, 1875, 2000 и 3318 см-1. Полосы 480 и 810 см"1 можно отнести к валентным колебаниям связи Si-O-Si в силикатных системах. Полоса 990 см"1 соответствует валентным колебаниям связи Si-O в группах Si-OH. Полосу 1110 см"1 можно отнести к асимметричным колебаниям Si-O-Si. Также полоса 1645 см — это деформационное колебание ОН в физически сорбированной воде, 1875 и 2000 см"1 соответствуют обертону и скелетным колебаниям кремнеземной матрицы. А полоса 3318 см" характерна для молекул воды, связанных водородной связью и физически адсорбированных на поверхности кремнезема.

На спектре аминированного аэросила А-380 (рис. 3.4) наблюдаются полосы поглощения аминированного кремнезема 1490, 1570, 1659, 2930 и 3200 см"1. Полоса 1490 см"1 соответствует деформационному симметрическому колебанию С-Н связи средней интенсивности. 1570 и 1659 см"1 - это колебания, соответствующие N-H связи в первичных аминах. 2930 см"1 является валентным колебанием С-Н связи. Следует отметить, что широкая полоса в области 3200 см"1 существенно уменьшила свою интенсивность вследствие введения на поверхность органических радикалов, уменьшающих гидрофильность поверхности. Практически не наблюдается полоса в области 990 см 1, характерная для силанольных групп. Это связано с протеканием поверхностных реакций между силанольными группами и 3-аминопропилтриэтоксисиланом.

На спектре аминированного аэросила А-380 с привитым спейсером (рис. 3.5) наблюдаются новые полосы 1540 и 1700 см"1, которые можно соотнести с характеристическими полосами поглощения амид I и амид II соответственно. Также четко выражена полоса, характерная для первичных аминогрупп — 3320 см 1. Появление интенсивной полосы 1360 см"1 обусловлено валентными колебаниями C-N в амидах (полоса амид III).

На спектре аминированного аэросила А-380 с иммобилизованным на спейсере Zn-протопорфирином (рис. 3.6) наблюдаются полосы 3000-3100 см"1, характерные для алкенов. Также присутствуют полосы, амид I, И, III (1360, 1540, 1700 см"1) характерные для первичных амидов. Полоса, соответствующая аминогруппам (3310 см"), уменьшается, что свидетельствует о присоединении Zn-протопорфирина по этим группам. На спектре аминированного аэросила А-380 с иммобилизованным флуоресцеином (рис. 3.7) наблюдаются полосы, характерные для ароматических групп 1410 см"1 [123]. Полученные спектральные данные подтверждают приведенные выше, схемы реакций с участием поверхностных соединений.

Модифицирование поверхности кремнезема фенилэтилсилильными группами

Исследование хроматографических свойств кремнеземов с пиренильными группами проводили в ЗАО ИЛИП. В качестве исходного раствора, при загрузке сорбента фуллеренами, использовался раствор фуллеренов в толуоле с концентрацией Сбо 579,7 мг/л и С7о 612,9 мг/л (по данным спектрофотометрического анализа) (табл. 4.6). Эксперименты заключались в насыщении колонки, заполненной тем или иным образцом сорбента, смесью фуллеренов с последующим элюированием фуллеренов путем пропускания через колонку толуола. Пробы растворов на выходе из колонки анализировались на фуллерены спектрофотометрическим методом.

Эксперименты проводились при использовании одинаковых колонок при отношении Н : D = 35.5-38.5. Загрузка образцов сорбентов в колонки колебалась в пределах от 27 до 29 мл. Степень насыщения образцов сорбентов смесью фуллеренов колебалась в пределах 0,5-0,6 мг/мл сорбента. В каждом эксперименте поддерживалась одна и та же скорость пропускания толуола через колонку колоночных объемов (к.о.) в час (0,5 к.о./ч).

Исследования хроматографических свойств сорбента с привитой пиренильной фазой проводили в гравитационном режиме в среде толуола, который, как известно, является хорошим растворителем для фуллеренов. В экспериментах использовалась стеклянная колонка, высотой 500 мм, диаметром 7 мм. Объём сорбента в эксперименте составил 19,2 мл.

Эксперимент проводили следующим образом: колонку заливали раствором фуллеренов в 15 мл толуола при нагрузке 0,7 мг фуллеренов на 1 мл сорбента.

Как видно из представленных данных, полученный нами сорбент обеспечивает хорошее разделение фуллеренов Сбо, Сю, при этом, выход чистого фуллерена С70 от вымытого из колонки, составляет 94,3%, а доля вымытого фуллерена С7о, от введенного в колонку составляет 89,13%. Таким образом, выход чистого фуллерена С70 от введённого в колонку, составляет 84%.

Эти характеристики позволяют считать сорбент, синтезированный в результате данной работы, перспективным хроматографическим материалом для разделения фуллеренов и получения чистого фуллерена Сю.

В заключение отметим, что разработанная нами методика синтеза сорбентов, существенно отличается от используемых известных методов получения сорбентов, предназначенных для разделения фуллеренов, отсутствием сложных дорогостоящих модификаторов, что делает её экономически привлекательной для использования в углеродных нанотехнологиях и получения чистых фуллеренов, необходимых для использования в медико-биологических исследованиях.

Исследование модифицированных кремнезёмов методом ИК-Фурье спектроскопии диффузного отражения

Для исследования образцов силикагеля КСК-2, силикагеля с привитыми фенилэтилхлорсилильными группами, с 4-(гидроксиметил)феноксиметильными группами, с Fmoc-Gly, с привитыми пиренильными группами использовали ИК-Фурье спектроскопию диффузного отражения по методике, изложенной в главе 2.10.

На спектре силикагеля КСК-2 (рис. 4.7) имеются полосы поглощения 480, 810, 990, 1110, 1645, 1875, 2000 и 3318 см"1. Полосы 480 и 810 см 1 можно отнести к валентным колебаниям связи Si-O-Si в силикатных системах. Полоса 990 см"1 соответствует валентным колебаниям связи Si-О в группах Si-OH. Полосу 1110 см"1 можно отнести к асимметричным колебаниям Si-O-Si. Также полоса 1645 см"1 это деформационное колебание ОН в физически сорбированной воде, 1875 и 2000 см" соответствует обертону и скелетным колебаниям кремнеземной матрицы. А полоса 3318 см" характерна для молекул воды, связанных водородной связью и физически адсорбированных на поверхности кремнезема.

Похожие диссертации на Синтез химически модифицированных кремнеземов для получения, иммобилизации и адресной доставки биологически активных веществ