Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Характеристика иерсиний и их распространение в объектах ветеринарно-санитарного контроля 8
1.2. Методы индикации и идентификации иерсиний 15
1.2.1. Бактериологический метод индикации Y. enterocolitica 16
1.2.2. Иммунологические методы 18
1.2.3. Методы ДНК-диагностики 22
2. Собственные исследования 35
2.1. Материалы исследований 35
2.2. Методы исследований 35
2.2.1. Выделение хромосомных ДНК бактерий 35
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК 37
2.2.3. Включение тритиевои метки в ДНК методом ник-трансляции 38
2.2.4. Включение биотиновой метки в ДНК методом ник-трансляции 39
2.2.5. Получение меченых зондов с помощью
полимеразной цепной реакции 40
2.2.6. Гибридизация ДНК с тритиевои меткой 41
2.2.7. ДНК-гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-зондами, меченными биотином 42
2.2.8. Методика гибридизации колоний 47
2.2.9. Методика полимеразной цепной реакции 48
2.2.10. Амплификация ДНК методом рассеянной затравки 49
2.2.11. Статистическая обрабока результатов 50
2.3. Результаты исследований 50
3 Разработка тест-системы индикации Y. enterocolitica на основе ПЦР 50
Разработка методов и тест-систем индикации Y. enterocolitica с использованием генных зондов 54
Разработка методик индикации патогенных штаммов Y.enterocolitica с использованием плазмидной ДНК 65
Оценка методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления Y.enterocolitica при мониторинге кормов и мясной продукции 72
Обсуждение результатов 78
Выводы 92
Предложения для практики 94
Список литературы
- Бактериологический метод индикации Y. enterocolitica
- Методы ДНК-диагностики
- Включение тритиевои метки в ДНК методом ник-трансляции
- Амплификация ДНК методом рассеянной затравки
Введение к работе
Актуальность темы
Обеспечение населения высококачественной и безопасной
продукцией является актуальной задачей современности. Эта актуальность
обусловлена возрастанием экологического неблагополучия под действием
"** различных факторов, приводящих к контаминации производств и продукции
опасными для здоровья человека и животных возбудителями заболеваний.
Получение высококачественной животноводческой продукции тесно связано с созданием эффективной системы ветеринарно-санитарного контроля, всей «пищевой цепи» - от кормов до готовой продукции.
Микробиологические критерии традиционно являются одним из главных показателей безопасности животноводческой продукции.
В последнее время все более актуальной проблемой является
индикация возбудителей кишечного иерсинеоза. Это заболевание
регистрируется по всей территории РФ и в других странах. ( Ющук Н.Д. и
щ др., 1987,2000; Ющенко Г.В., 2000; Кононенко А.Б. и др., 2000; Славчев
Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989). По данным ряда исследователей кишечный
иерсиниоз по значимости среди пищевых зоонозов занимает вторе место
после сальмонелеза.
<^ Возбудителем кишечного иерсиниоза является Y. enterocolitica.
Животные разных видов являются источниками возбудителя инфекции. Иерсинии выделены от грызунов, свиней, коров, диких животных и птицы (Кирьянов Е.А. и др., 1989; Каланадзе Е.П. и др., 1991).
Бактерии У. enterocolitica встречаются в овощах, корнеплодах,
fc зеленых кормах, в молоке ( Славчев Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989 ).
Мясо может быть контаминировано в процессе убоя и разделки животных - бактерионосителях. В последнее время серьезное значение в инфицировании иерсиниями приобретает водный фактор. Y. enterocolitica часто выделяют из открытых и закрытых водоемов,
подземных вод, колодцев, питьевой воды, сточных вод (Старыгина Г.А. и др., 1989).
Прямым следствием распространения иерсиний в животноводческих
хозяйствах является обсемененность пищевых продуктов животноводства:
молока (1,0-6,0%), мяса (1 »0-6,0%), тушек цыплят (2,0-12,0%), поверхности
* яиц (0,5-8,0%) (Ющенко Г. В., Дунаев В. И., 1980).
Существующие методы классического бактериологического анализа, предусматривают выделение чистых культур на селективных питательных средах, что делает эти анализы длительными и трудоемкими.
Кроме того, влияние различных биотических и абиотических факторов может приводить к L-трансформации в популяции микроорганизмов и появлению L-форм, которые трудно быстро выявить с помощью классических бактериологических методов (Прозоровский СВ. и др., 1981; Павлова И.Б., 1999).
Наиболее перспективными в плане чувствительности и
% специфичности индикации и идентификации микроорганизмов показали
себя методы генной диагностики (ДНК-гибридизация, амплификация генов)
(Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., 1976; Антонов А. С. др., 1980; Панин А.Н. и
др., 1997; Palva А.А., 1983; Hachiraoto J. et al., 1995). Они позволяют выявлять
/^ микроорганизмы и вирусы в смешанных культурах, обнаруживать L-формы
бактерий и дифференцировать патогенные культуры от непатогенных (Гинцбург А.А., 1998; Falkow S., Moseley S., 1982; Hill W., Modden J., 1983; Moseleu S.A., Hyg J., 1989; Rifai S. et. al., 1989).
Вследствие сказанного, разработка методов и тест-систем ускоренной
^ индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-
диагностики — одна из важных задач ветеринарно-санитарного контроля. Актуальным является адаптация методов к конкретным объектам и дифференциация патогенных форм бактерий.
Цель и задачи исследований Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики.
В задачи исследований входило:
*"*' - разработать тест-систему индикации Y.enterocolitica на основе ПЦР;
разработать методы и тест-сиситемы индикации Y.enterocolitica с использованием ДНК-зондов, меченных биотином и тритием;
разработать метод индикации патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК;
провести оценку методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления
Y. enterocolitica при мониторинге кормов и мясных продуктов.
Научная новизна. Разработаны тест-сиситема индикации Y.enterocolitica в
кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных
биотином, и тест-сиситема на основе ПЦР; разработана методика индикации
'Щ патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК;
разработана тест-сиситема индикации патогенных и непатогенных штаммов
Y. enterocolitica на основе амплификации и ДНК-гибридизации.
Практическая ценность. На основании результатов исследований
^ разработаны:
- Методические указания по индикации Y. enterocolitica методом
полимеразной цепной реакции (утверждены Департаментом
ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г., № 13-5-2/196).
- Методические рекомендации по индикации Y. enterocolitica в
^ продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены
Отделением ветеринарной медицины РАСХН 18. 03. 2004 г). Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка
и освоение производства нового поколения лекарственных средств для
животных и их применение в ветеринарии» (г.Ставрополь, 2000);
- Международной конференции молодых ученых «Научные основы
производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2000
Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ВНИТиБП РАСХН (г. Щелково, 2001 г.);
Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.);
заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2004 г.);
межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.). Публикации. Результаты исследований отражены в 7 научных
статьях.
Бактериологический метод индикации Y. enterocolitica
В основе бактериологического метода лежит подращивание на холоде с использованием всевозможных добавок к средам обогащения и подращивания, с последующим пересевом на дифференциально диагностические среды. Для освобождения материала от сопутствующей микрофлоры его кратковременно обрабатывают раствором щелочи. Пересев осуществляется на среды СБТС и Эндо. На среде Эндо иерсиний вырастают в виде достаточно маленьких, выпуклых, гладких лактозоотридательных колоний, диаметром 0,3- 0,5 мм. После 36-40 часов колонии увеличиваются в размере, приобретая розовый оттенок. На среде СБТС колонии крупнее (2-4 мм), выпуклые, сухие, голубого цвета (Ющенко Г. В., Дунаева В.И., 1980; Ценева Г.Я., 1992, 1997).
Для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза из клинического материала, из объектов окружающей среды использовалась также питательная среда из панкреатического гидролизата рыбной муки и очищенной желчи (КРС) крупного рогатого скота. Дифференцирующие свойства новой питательной среды основаны на наличии в ее составе мочевины. Гидролиз мочевины происходит только при воздействии уреазы иерсиний, при этом колонии окрашиваются в синий или голубой цвет.
Получена новая питательная среда для выделения и культивирования возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Она имеет преимущество перед средой Эндо по дифферинцирующим и инпибирующим свойствам. На этой среде быстро обнаруживается и отличается Yersinia pseudotuberculosis от Y. enterocolitica и от Escherichia coli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, К. rhinoscleromatis, Hafma, Enterobacter, а также Citrobacter непосредственно при помощи цвета; Proteus inconstans- по роению. Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным и другим свойствам. Отнесенные по биохимическим свойствам к Y. enterocolitica культуры подлежат серологической идентификации в реакции агглютинации.
Идентификацию патогенных иерсиний проводят по тестам аутоагглютинации, кальцийзависимости, температурозависимой морфологии колоний. И, наконец, серологическая идентификация в реакции агглютинации с использованием диагностических сывороток СВИ.
За рубежом проводится идентификация на специальных питательных средах: Congo-red magnezium oxalate agar - установление способности к кальцийзависимому росту и усвоению Конго красного; пиразинамидазный тест - наличие пиразинамидазы у иерсиний.
Для индикации иерсиний можно использовать бактериофаги (Васильев Д.А., и др. 2003). По данным авторов наибольшей литической активностью по отношению к изучаемым культурам обладал фаг YE/CB-6. Шесть бактериофагов Y. enterocolitica обладали выраженной специфичностью. Изучение температурной устойчивости показало, что выделенные бактериофаги являются термолабильными и по скорости инактивации мало отличаются друг от друга. По чувствительности к хлороформу селекционированные фаги Y. enterocolitica делятся на 2 группы: в 1-ю входят 2фага, их выживаемость в течении 10 мин составила более 50%, во 2-ю-4фага, выживаемость их была менее 50%, т.е. бактериофаги чувствительны к хлороформу. Все бактериофаги имели сравнительно невысокий процент адсорбции на чувствительных клетках, средний процент адсорбции составлял 58%. Опыты показали, что возможно использовать селекционированные фаги для типирования бактерий Y. enterocolitica.
Однако фаготипирование требует выделения чистых культур, что увеличивает время диагностики.
Таким образом, индикация и идентификация возбудителей кишечного иерсинеоза классическим бактериологическим методом Y. enterocolitica процесс длительный и трудоёмкий, кроме того, рост микроорганизмов на различных средах в условиях конкуренции не всегда приводит к адекватным результатам идентификации, что снижает объективность оценки результатов.
Развитие ветеринарно-санитарной экспертизы и сертификации животноводческой продукции и кормов в России и за рубежом диктует необходимость перехода к наиболее специфичным, чувствительным и ускоренным методам индикации и идентификации бактерий.
В последние годы для контроля безопасности качества продукции животноводства и ее сертификации стали использоваться иммунологические методы. Среди иммунологических методов анализа наибольшее распространение получили реакции коаглютинации, иммунофлуоресценции и в, особенности, метод твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, (ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay).
Методы ДНК-диагностики
Наиболее перспективными в плане специфичности и чувствительности индикации микрооганизмов в целях определения показателей безопасности и качества продукции животноводства являются методы генной дианостики.
В большей степени методы генной диагностики вначале получили развитие в медицинской практике. Преимущество этих методов в идентификации микроорганизмов убедительно показано в обзоре Гинзцбурга А.Л. (1998). Автор отмечает, что развитие медицинской микробиологии непосредственно связано с совершенствованием методов идентификации патогенных микроорганизмов. Особенно большие успехи в этой области были достигнуты в последние несколько десятилетий. Развитие этого направления медицинской микробиологии было обеспечено, в первую очередь, фундаментальными исследованиями в области химии, иммунологии и генетики.
Генодиагностика - это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Генодиагностика - относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Начиная с 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф, Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что основной принцип, лежащий в основе всего живого - принцип комплементарности. Однонитевая цепь ДНК взаимодействует, образуя двунитевый комплекс только с цепью ДНК, обладающей комплементарной последовательностью. С этих пор данный принцип стал широко и успешно использоваться для решения различных более частных проблем, в том числе и для диагностики патогенных микроорганизмов.
Среди методов генодиагностики наиболее перспективными в плане практического применения для индикации и идентификации возбудителей инфекций являются методы гибридизации нуклеиновых кислот; ПЦР, ДНК-микрочиповая технология.
Гибридизация - процесс, в ходе которого одноцепочечная нуклеиновая кислота при отжиге с комплиментарной молекулой образует двухцепочечный дуплекс. В основе метода гибридизации лежит специфическое взаимодействие гомологичных последовательностей полинуклеотидных цепей ДНК или РНК, которое осуществляется путём спаривания комплиментарных оснований. Сущность одного из основных методов гибридизации нуклеиновых кислот заключается в том, что исследуемые образцы нуклеиновых кислот (один из образцов имеет метку) денатурируют до одноцепочечных молекул, инкубируют в определенных условиях гибридизации, отделяют не прореагировавшие молекулы, а гибридные молекулы определяют по уровню включения метки (Антонов А.С., 1980; Херрингтон С, Макги Д, 1999; Denhardt D. Т., 1966; Church R В., 1973; Baker R. F, 1977).
Исторически метод гибридизации нуклеиновых кислот использовался в таксономии микроорганизмов как для упорядочения существующей классификации, так и для определения таксономического положения вновь выделенных штаммов. (Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., 1976; Медников Б.Н., 1978; Антонов А.С., 1980).
До конца 80-х гг. реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой генодиагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, которую используют в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также желательно соответствовать гену, кодирующему синтез одного из факторов патогенности. При использовании молекулярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и дать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов окруясающей среды.
Включение тритиевои метки в ДНК методом ник-трансляции
Под вакуумом при комнатной температуре высушивали 20 мкл препарата 3Н 1НТФ. Затем добавляли инкубационную смесь в объеме 50 мкл.
Инкубационная смесь состояла из 5 мкл буфера (10х) для ник щ трансляции; 10 мкл ДНК-фрагмента (100-ЗООнм); 3 мкл немеченных сІНТФ (по 1нМ каждого нуклеотида); 1 мкл ДНКазы (0,1 мкг/мл); 1 мкл ДНК-полимеразы 1 Е. coli (3-5 ед.). Смесь перемешивали встряхиванием и инкубировали 2 часа при 15С.
Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,5 этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). С помощью осаждения 10% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) определяли процент Н о НТФ, включившихся в ДНК. Для этого наносили известный объем (до 10 мкл) пробы в центр диска из стекловолокна (ватман GF/C, диаметр диска 2,4 см). Пробу такого же объема вносили в пробирку, содержащую 100 мкл раствора ДНК из спермы лосося (500 мкг/мл в 20 мМ ЭДТА). Добавляли 5 мл охдажденной во льду 10%-ной ТХУ, размешивали и охлаждали во льду в течение 15 минут. Собирали осадок, отфильтровывали раствор через другой диск из стекловолокна.
Промывали фильтр 6 раз 5 мл охлажденной во льду 10% ТХУ, затем добавляли 5 мл 95%-ого этанола. Высушивали оба фильтра под лампой накаливания. Помещали фильтры в сцинтилляционные флаконы.
Определяли радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном р-счетчике, в сцинтилляционной жидкости на основе толуола. На первом фильтре измеряли общую радиоактивность в пробе, на втором -радиоактивность, включенную в нуклеиновые кислоты.
С помощью этой процедуры количественно осаждаются нуклеиновые кислоты длиной 20 нуклеотидов.
Ник-транслированную ДНК отделяли от невключившихся сІНТФ на микроколонке с сефадексом G-50 обычной хроматографией. Приготовляли колонку с сефадексом G-50 в подходящей стеклянной пробирке объемом 5 см3. Промывали колонку несколькими объемами буфера ТЕ (рН=8,0). Наносили на колонку пробу ДНК (в объеме 200 мкл). Промывали пробирку, в которой находилась ДНК, приблизительно 100 мкл буфера ТЕ (рН=8,0) так, чтобы скорость потока составляла около 075 мл/мин.
В пробирки типа Эппендорф собирали 12-15 фракций (по 0,5 мл). ДНК не включается в гранулы сефадекса и выходит в исключенном объеме (обычно составляющем 30% общего объема колонки). Таким образом, первый пик
радиоактивности дают нуклеотиды, включенные в ДНК, а следующий за ним пик - свободные 3Н (1НТФ. Процент 3Н сІНТФ, включившихся в ДНК, определяли путем изменения радиоактивности пробы до и после гель-фильтрации.
Собирали радиоактивные фракции, составляющие первый пик, и хранили их при минус 20С.
В находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносили следующие реактивы: ДНК 1мкг, 10-кратный объем буфера для ник трансляции (ЮхНК) - 5 мкл, 5 мкл холодных дезоксинуклеозидтрифосфатов; воду до конечного объема 50 мкл, 0,4 мМ bio-7-dATP - 2,5 мкл, ДНКазу 1 (0,4-1,0 нг/мкг ДНК) - 2 мкл, ДНК-полимеразу 1 (4 ЕД) - 2 мкл. Буфер 1 ОхНК содержал: 500 мМ трис-НС1, рН 7,6; 50 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанол.
Все компоненты перемешивали аккуратным встряхиванием пробирки и инкубировали 2 часа при 15С. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп-буфера (300 мМ этилендиамитетрауксусная кислота-ЭДТА, рН 8,0). Невключившиеся нуклеотиды удаляли хроматографией на сефадексе, как описано.
Амплификация ДНК методом рассеянной затравки
Для проведения реакции готовили следующие реактивы: -Юхбуфер для мечения: 500 мМ трис-HCl, рН 8,0; 100 мМ MgCl2; 1мМ дитиотриэтола-ДТТ; 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина-БСА; -гексануклеотиды: 62,5 ОДгбо/мл; -20 РБ: ЇМ КС1, 200 мМ трис-HCl, рН 8,3; 30 мМ MgCl2, 0,2% (в/о) желатина, по 4 мМ сїАТФ, сІЦТФ, сІГТФ; 2,6 мМ (ЛТФ; 1,4 мМ Ьіо-11-сІУТФ.
Смесь инкубировали при 93С 10 мин. Добавляли ДНК полимеразу Taq 0,5 мкл (1 ЕД). Дальнейшую реакцию амплификации проводили по следующей программе: Отжиг— 1мин, при 48С; Элонгация — 1 мин, при 72С; Денатурация - 1 мин, при 95 С
Число циклов- Результаты исследований подвергали статистической обработке по Стьюденту с определением средней арифметической, среднего квадратичного отклонения, критерия достоверности и коэффициента корреляции.
На первом этапе исследований решалась задача создания тест-системы для индикации иерсиний в кормах и мясных продуктах.
Подготовка проб к исследованию включала этапы элюирования и концентрирования бактерий с помощью дифференциального центрифугирования. Основой индикации являлась реакция амплификации. Составляющими тест-системы были набор для выделения ДНК с лизирующим реагентом гуанидинтиоизоционатом и сорбентом NucleoS, набор для постановки ПЦР и реагенты для детектирования амплифицированной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Для индикации микроорганизмов контаминированные иерсиниями образцы кормов и мясопродуктов измельчали, гомогенизировали и бактерии элюировали физиологическим раствором. Очистку от клеточного дебриса и концентрирование бактерий осуществляли дифференциальным центрифугированием.
Выбранный нами реагент гуанидинтиоизоционат способствовал лизису клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента с гуанидинтиоизоционатом ДНК активно связывается с сорбентом NucleoS, входящим в состав набора, затем легко отмывается от белков и солей промывочным раствором. Элюированная из сорбента ДНК ЭкстраГеном или чистой водой в дальнейшем была использована нами в ПЦР. ПЦР проводилась с ДНК, выделенной из исследуемых образцов. К 2мл ДНК добавляли рабочую смесь реактивов, содержащую: - 2 мкл "MIX" - 9 мкл деионизованной воды - 0,1 мкл Taq — полимеразы.
Смесь реактивов «MIX» содержала праймеры к ДНК Y. enterocolitica.
При разработке тест-системы для синтеза в качестве праймеров были использованы нуклеотидные последовательности ДНК Y.enterocolitica: Kwaga 38 (S -GAACTCGATGATAACTGGG-S ) и Feng 19 (5 -GGAGTATTCATATGAAGCGTC-3,).
В результате исследований были отработаны параметры постановки полимеразной цепной реакции с использованием данных праймеров. Оптимальные режимы амплификации для соответствующих этапов были следующими: 1) денатурация - 95С, 2) отжиг - 55С, 3) элонгация- 72С. Количество циклов - 35.
После проведения ПЦР с выделенными матричными ДНК и указанными праймерами полоса амплификата наблюдалась только в реакционной смеси, содержащей ДНК Y.enterocolitica. В системах с ДНК других бактерий амплификация не проходила (рис.1).
