Введение к работе
Актуальность темы. Сальмонеллез - инфекционное заболевание поражающее многие виды животных, птиц и человека.
Возбудители этого заболевания существуют в природе во всс\ органических и неорганических субстанциях, чаще они локализуют» и печени, кишечнике, лимфатических узлах и других органах животных и человека, а также в окружающей среде.
Практически все объекты ветеринарно-санитарного и эколошчесмло контроля могут быть поражены возбудителями сальмонеллеза.
Возрастающая индустрия производства и потребления нищений продукции, кормов, а также экологические аспекты охраны окружаюше-н среды требуют быстрого и эффективного контроля зараженное ні возбудителями сальмонеллеза.
Существующие методы обнаружения и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля, основанные на использовании дифференциально-питательных сред, длительны и трудоемки. Кроме того, значительно меняющиеся фенотипические признаки семейства Enterobacteriaceae делают культурально-биохимические тесты не всегда корректными при идентификации сальмонелл.
Относительно быстрые серологические тесты могут даваїь ложноположительные результаты из-за фона сопутствующей микрофлоры и биохимических компонентов, входящих в состав объекгов исследования /[in получения достоверных результатов указанными меюдами феб>еіся предварительное обогащение микробных клеток, что приводит к снижению экспрессное.
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот и полимеразнал
'цепная реакция являются высокоспецифичными и чувствительными
методами в обнаружении и идентификации микроорганизмов (Антонов АС
1980; Шагинян И.А и др. 1992, Sklar J 1985, Brenner D. 1986; Thomas
Elizabeth J. et all 1991; Kruger G. et all 1992; Kupperveld F J.M. et all 1992)
Метод гибридизации нуклеиновых кислот, основанный на специфическом связывании известной йталонной нуклеошдний последовательности (генного зонда) с комплементарными куклеошдиымм последовательностями ДНК или Р11К исследуемых микроорі анизмон, применяется для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии. (Дерюшева СЕ. 1993; Асеев II В и др 1994, Орешкова И др 1995; Горбовнцкая М. 1996; Донской Д И 1996, I alkovv S el all 1982; Bryau R.N. et all 1984, Waclismiith K. 1986, Cuiiale M S et all 1990,)
В настоящее время известны высокоенеиифичные нуклеошдимс последоваїельносіи, используемые в качестве генных зондов, позволяющие
iie только определять видовую принадлежность микроорганизмов в смеси кулыур без предварительного обогащения, но дифференцировать гокснгенные и нетоксигенные штаммы. (Hill W. et all 1983; Hill W. et all 1983; MoseleyS.L. 1985; Wolf-WatrH. 1987).
Несмотря на определенные достижения применения генных зондов в областях геносистематики, медицины, ветеринарии, методы генного зондирования недостаточно используются в практике ветеринарно-санитарного и экологического контроля.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка ускоренных методов обнаружения и вдентификации сальмонелл в продуктах, кормах и других объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля с использованием меченых ДНК зондов.
Были поставлены следующие задачи:
-
Модифицировать способы предварительной обработки проб и выделения ДНК сальмонелл применительно к различным объектам ветеринарно-санитарного п экологического контроля и провести их сравнительный анализ. ,
-
Разработать методики ускоренной индикации сальмонелл в мясе, мясопродуктах, кормах, воде и воздухе на основе биотинилированных п меченых тритием ДНК зондов.
3 Разработать методики ускоренной идентификации сальмонелл на
основе тотальных ДНК или*., высокоспецифичных нуклеотидных
последовательностей. " ,
4. Создать тест-наборы диагностикумов и показать возможность
приборной реализации методов для анализа в стационарных и
нестационарных условиях.
Научная новизна. Разработаны методики ускоренной индикации
сальмонелл на основе меченых тритием и биотинилированных генных зондов
для конкретных объектов ветеринарно-санитарного и экологическою
контроля ( мясо, мясопродукты, корма, вода и воздух).
Показана возможность высокоспецифичной индикации сальмонелл с использованием амплификационного генного зонда в смеси микроорганизмов без предварительного обогащения.
Разработана схема ускоренной' индикации сальмонелл на основе тотальных хромосомных ДНК бактерий.
Созданы тест-наборы на основе биотинилированного и тритиевого ДНК зондов, пригодные для проведения анализов в различных объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля.
Показана возможность приборной реализации методов индикации и идентификации сальмонелл генными зондами в полевых и стационарных условиях.
Практическая ценность и реализация результатов. На осноианлп проведенных исследований разработаны "Методические рекомендации >н, определению Sal. typhimurium в продуктах н кормах с использованием ДИК зондов" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г ї
Созданы тест-наборы для коммерческого тиражирования, показало возможность приборной реализации методов в полевых и сташюнарньч условиях.
Апробация работы Материалы диссертационной рабогы доложены «м Международной конференции "Актуальные проблемы ветеришрік>іі медицины и ветерннарно-санитарного коїпроля сельскохозяйственных ігродуктов" (Москва .1997г.), на межлабораторном совещании иа^чныч сотрудников ВНИИ вегеринарной санитарии, гигиены и экологии (1УУ7г.)
Публикации. По теме диссертации опубликовано три научных статьи
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, o6«>j>:i литературы, собственных исследований, обсуждения получешшч результатов, выводов, списка литературы и приложения
Похожие диссертации на Разработка тест-систем ускоренной индикации и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного экологического контроля на основе генных зондов
