Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля
Критерии и методы оценки безопасности и качества животноводческих производств и продукции 16
Микробные контаминации и их оценка 20
Идентификация продукции и определение фальсифицирующих примесей 53
Методы генной диагностики и их роль в оценке безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля 65
Автоматизированные системы и приборы контроля качества и безопасности 92
ДНК-микрочиповая технология 98
Собственные исследования 105
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 105
Микробиологические методы исследований 105
Методы бактериологического анализа эшерихий, сальмонелл, стафилококков 106
Определение чувствительности бактерий к действию антибиотиков 109
Метод выращивания бактерий в полужидком агаре на мембранных фильтрах 109
Получение и определение L-форм бактерий 110
Электронномикроскопические исследования ПО
Методы ДНК-диагностики
2.3.1. Выделение и очистка ДНК бактерий 111
2.3.2. Выделение и очистка ДНК из тканей животных 113
2.3.3. Включение тритиевой метки в ДНК методом ник-трансляции 114
2.3.4. Включение биотиновой метки в ДНК методом ник-трансляции 115
2.3.5. Включение метки в ДНК методов «рассеяной» затравки 116
2.3.6. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции 117
2.3.7. Точечная ДНК-гибридизация с биотиновой меткой 118
2.3.8. Гибридизация ДНК с тритиевой меткой 119
2.3.9. ДНК-гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-зондами меченными биотином 120
2.3.10. Методика гибридизации колоний 125
2.3.11. Методика полимеразной цепной реакции
2.4. Методика иммудиффузии в геле 127
2.5. Статистическая обработка результатов 128
Результаты исследований 129
ГЛАВА 3. Разработка методов и тест-систем индикации и идентификации микроорганизмов в объектах ветеринарно санитарного контроля на основе ДНК-диагностики 129
3.1. Идентификация бактерий в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля на основе гомологии нуклеиновых кислот методом гибридизации колоний 129
3.2. Разработка модификации метода ускоренной идентификации бактерий на основе гомологии ДНК меченной биотином 136
3.3. Разработка тест-систем индикации бактерий с использованием генных зондов 145
3.4. Разработка метода дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации
на мембранных фильтрах 161
Индикация бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля на основе ПНР с меченными дезоксинуклеозидтрифосфатами 184
ГЛАВА 4. Разработка методов и тест-систем идентификации видовой принадлежности мяса и мясопродуктов 196
Разработка методов и тест-систем идентификации говядины на основе ДНК-диагностики 196
Разработка тест-системы определения видовой принадлежности мяса и субпродуктов на основе иммунодиффузии в геле 205
ГЛАВА 5. Приборная реализация ускоренных методов оценки безопасности качества 207
Разработка автоматизированных систем на основе ДНК диагностики
Разработка тест-систем и технических средств для проведения анализа в нестационарных условиях 220
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 233
Выводы 256
Предложения для практики 259
Список литературы
- Микробные контаминации и их оценка
- Определение чувствительности бактерий к действию антибиотиков
- Разработка модификации метода ускоренной идентификации бактерий на основе гомологии ДНК меченной биотином
- Разработка тест-систем и технических средств для проведения анализа в нестационарных условиях
Микробные контаминации и их оценка
С этой целью технические регламенты не должны оказывать на торговлю более ограничительных воздействий, чем это необходимо для достижения законных целей, принимая в расчет риски, которые возникали бы при их невыполнении. Такими законными целями являются, в частности, требования национальной безопасности; предотвращения обманной практики; защита здоровья или безопасности людей, жизни или здоровья животных или растений, либо охраны окружающей среды.
Члены ВТО должны способствовать использованию согласованных санитарных и фитосанитарных мер на основе международных стандартов, предписаний и рекомендаций, разработанных соответствующими международными организациями, включая Комиссию «Кодекс
Алиментариус», Международное эпизоотическое бюро и соответствующие международные и региональные организации, действующие в рамках Международной конвенции по защите растений, без предъявления при этом членами требований внести изменения в их законы по охране жизни или здоровья людей, животных или растений.
С целью гармонизации санитарных и фитосанитарных мер члены должны основывать свои санитарные или фитосанитарные меры на международных стандартах, предписаниях или рекомендациях, когда таковые имеются.
В основу санитарных или фитосанитарных мер должна быть положена соответствующая обстоятельствам оценка рисков для жизни или здоровья людей, животных или растений с учетом методов оценки риска, разработанных международными организациями. При оценке рисков учитываются имеющиеся научные обоснования; соответствующие методы инспектирования, выборочного контроля и испытаний; степень распространения конкретных заболеваний или вредителей; наличие зон, свободных от заболеваний или вредителей; соответствующие экологические условия карантинный режим.
При этом должны учитываться соответствующие экономические факторы, а именно: потенциальный ущерб от снижения объема производства или продаж в случае проникновения, укоренения или распространения какого-либо вредителя или заболевания, расходы по борьбе с ними; относительная эффективность альтернативных подходов к ограничению рисков. С другой стороны, необходимо добиваться сведения к минимуму негативного воздействия на торговлю.
Необходимо отметить, что гармонизация правил и методов оценки безопасности и качества продукции является динамичным и трудным процессом. Существует борьба мнений и разногласия между тремя центрами мировой торговли - США, Японией и ЕС в отношении того, какие нормативные документы (НД) следует рассматривать в качестве международных стандартов в духе соглашения ТБТ/ВТО, так как в этом случае эти НД могут служить отправным материалом для создания национальных законов и их оценки, как возможных барьеров для торговли.
Несмотря на определенные трудности, процесс взаимопонимания при разработке стандартов неуклонно движется вперед, а стандартизация превращается в ключевое звено современной политики в сфере торговых отношений.
В начале 1999 года ИСО провела переговоры с ведущими международными организациями с целью интенсификации взаимного сотрудничества в области стандартизации. Эта инициатива ИСО получила положительный отклик и привела к созданию «Форума действий в сфере стандартизации на глобальном рынке и принятию «Меморандума о взаимопонимании».
Разработка критериев и методов оценки безопасности и качества продовольственного сырья и продукции животного происхождения является одним из важных элементов стандартизации и сертификации указанной продукции.
Под качеством сельскохозяйственного сырья и продукции понимается совокупность свойств, обеспечивающих ее питательную ценность и безопасность для здоровья потребителя, надежность состава и сохранения потребительских свойств. Безопасность продукции означает отсутствие токсичного, канцерогенного, мутагенного или иного неблагоприятного воздействия ее на организм человека. Показатели качества и безопасности животноводческого сырья и продукции, определяемые в Системе обязательной сертификации ГОСТ Р, представлены в Санитарных правилах и нормах (СанПиН 2.3.2. 560-96).
Ветеринарно-санитарная оценка животноводческой продукции и ветеринарно-санитарная экспертиза проводиться на основе ветеринарно-санитарных правил. В настоящее время разработан проект Правил (ВетПиН 13.7.1-2000), который в целом соответствует международным требованиям. В правилах представлен широкий спектр диагностируемых инфекционных и инвазионных заболеваний животных, а также определены более совершенные методы исследований, например, методы идентификации мяса и мясопродуктов на основе ДНК-диагностики.
Способы определения показателей безопасности и качества продовольственного сырья и продуктов питания, приведенные в соответствующих томах «Кодекса Алиментариус» основаны на органолептических, физико-химических, биохимических, иммунологических, микробиологических и других методах анализа. Различают арбитражные методы количественного анализа и скрининговые методы с качественной оценкой показателей.
Определение чувствительности бактерий к действию антибиотиков
Другим важным аспектом ветеринарно-санитарной оценки животноводческой продукции является ее идентификация и определение фальсифицирующих примесей. Идентификация продукции является одним из важнейших элементов ветеринарно-санитарной экспертизы и сертификации (Бутко М.П.,1984, Родин В.И., 1995, Хвыля СИ., 1998). Эти положения отражены в «Правилах проведения сертификации пищевых продуктов и продовольственного сырья», в «Федеральном законе о безопасности и качестве пищевых продуктов». Сертификация продовольственного сырья и пищевых продуктов животного происхождения осуществляется после ветеринарно-санитарной экспертизы, проводимой в соответствии с действующими ветеринарно-санитарными правилами .
Для обеспечения страны высококачественной продукцией возросла необходимость идентификации мяса и мясопродукции. Отсутствие такого контроля способствует появлению в оптовой и розничной торговле недоброкачественной и даже фальсифицированной мясной продукции, что представляет серьезную угрозу здоровью населения.
Фальсификация может рассматриваться как действия, направленные на ухудшение потребительских свойств товара или уменьшение его количества при сохранении наиболее характерных, но не существенных для его использования по назначению свойств (Писарева В.М., 1996 ).
Мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчености, консервы, полуфабрикаты относятся к наиболее ценным продуктам питания, поэтому они попадают в разряд наиболее часто фальсифицируемых продуктов. Критерии идентификации мяса и мясных продуктов изложены в соответствующих нормативных документах («Мясо. Технические условия и методы анализа» 1997, «Колбасы. Технические условия и методы анализа» 1997, «Консервы мясные. Технические условия» 1997).
При идентификации могут использоваться органолептические, морфологические, биохимические, иммунологические и молекулярно-биологические критерии.
Так, например, методом газовой хроматографии в экстрактах мышечной ткани различных видов животных определяли углеводороды, циклобутаноны и полиненасыщенные жирные кислоты, обеспечивающие межвидовые различия (Helle N. et al., 1996). Изучали холестерол и его эфиры, жирнокислотный состав и основные физико-химические характеристики липидов и липопротеинов. Последние методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности фракционировались на липопротеины высокой и низкой плотности. По многим из этих показателей обнаружили определенные видовые различия, однако на основании этого пока невозможно осуществлять количественную детекцию видовой принадлежности мяса и мясопродуктов (Paz de Репа М.,1998).
Видовую принадлежность сырого и термообработанного мяса крупного рогатого скота, кур и кроликов определяли масс-спектрометрическим анализом, выявляя различия в актинах, гемоглобинах, миоглобинах и альбуминах (Taylor A et al., 2000). Результаты анализов по заключению авторов были удовлетворительными, однако проведение таких тестов требовало сложного и дорогостоящего оборудования, что создавало определенные трудности. Методом электронного парамагнитного резонанса идентифицировали видоспецифичные пептиды тяжелых цепей атриал-специфичного миозина кур (Sakurai М et al., 1997). Этот метод также не нашел широкого распространения. Известен также метод, основанный на безинструментальном иммунохроматографическом анализе на бумажных стрипах с визуальной оценкой конечных результатов. Разрешающая способность подобных тестов должна находиться в пределах 100 нг/мл антигена в экстракте анализируемого мышечного образца. Видовая детекция обработанных мясопродуктов может быть основана на термостабильных белках, сохранивших нативную конформацию, или отдельных тест-системах для денатурированных белков. Поэтому необходимы методы выявления как термостабильных, так и термолабильных видо - и органоспецифичных белков. Методом газовой хроматографии в экстрактах мышечной ткани различных видов животных определяли углеводороды, циклобутаноны и полиненасыщенные жирные кислоты, обеспечивающие межвидовые различия. Изучали холистерол и его эфиры, жирнокислотный состав и основные физико-химические характеристики липидов и липопротеинов. По многим из этих показателей обнаружили определённые видовые различия, однако, на основании этого пока невозможно осуществлять количественную детекцию видовой принадлежности мяса и мясопродуктов.
Кроме того, данные по изучению липидного состава не всегда адекватно можно использовать в качестве критериев для определения видовой принадлежности продукции, так как эти характеристики могут значительно меняться при различных условиях кормления животных. Наиболее перспективными в плане определения видовой принадлежности являются методы ДНК-диагностики, позволяющие проводить анализ как сырья, так и продукции, подвергнутой термической обработке.
Разработка модификации метода ускоренной идентификации бактерий на основе гомологии ДНК меченной биотином
После добавления солевого буфера содержимое пробирки перемешивали до получения гомогенной суспензии и центрифугировали 10 секунд при 5000g при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли. Отмывку солевым буфером проводили дважды. После этого, осадок подсушивади при температуре 65С, не болееЗ мин. Затем вносили 100 мкл элюирующего буфера. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 секунд, до получения гомогенной суспензии, после чего инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре, или 3-4 мин при 65С. Проводили повторное суспендирование и центрифугировали 2 мин при 12000 g при комнатной температуре. Супернатант, содержащий ДНК, переносили в чистую пробирку и хранили при температуре минус 20С до использования.
2.3.2. Выделение и очистка ДНК из тканей животных
Для выделения ДНК использовали СТАВ-буффер, состоящий из 2%-СТАВ (цетилтретбутиламмонийбромид), 1.4M-NaCL, ЮОмМ TrisHCL до рН 8.0H20MMEDTA.
5 г говядины растирали в ступке с 20 мл СТАВ-буффера при 60-65 С. Гомогенат оставляли на водяной бане (Т=65 С) на 20-30 мин. Затем добавляли 15 мл хлороформа и встряхивали до образовании эмульсии. Центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Отбирали верхний прозрачный слой в новую колбу и повторяли обработку хлороформом. Добавляли 15 мл охлажденного до 0 С изопрапанола и оставляли на 30 мин при 0 С. Центрифугировали 20 мин при 15000 об/мин, осадок, состоящий из ДНК, промывали 5 мл 72% этанола, подсушивали и растворяли в дистиллированной воде.
Реакцию проводили в следующем порядке: 20 мкл метки Н сІНТФ высушивали под вакуумом при комнатной температуре. Затем добавляли инкубационную смесь в объеме 50 мкл. Инкубационная смесь состояла из: 5 мкл буфера (10х) для ник-трансляции; 10 мкл ДНК-фрагмента (100-300нм); 3 мкл немеченных ёНТФ (по 1нМ каждого нуклеотида); 1 мкл ДНКазы (0,1 мкг/мл); 1 мкл ДНК-полимеразы 1 Е. coli (3-5 ед.).
Смесь перемешивали встряхиванием и инкубировали 2 часа при 15С. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,5 этилендиаминтетрауксусной кислоты - ЭДТА. С помощью осаждения 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) определяли % Н ёНТФ, включившихся в ДНК. Для этого наносили известный объем (до 10 мкл) пробы в центр диска из стекловолокна (ватман GF/C, диаметр диска 2,4 см). Пробу такого же объема вносили в пробирку, содержащую 100 мкл раствора ДНК из спермы лосося (500 мкг/мл в 20 мМ ЭДТА). Добавляли 5 мл охдажденной во льду 10%-ной ТХУ, размешивали и охлаждали во льду в течение 15 минут. Собирали осадок, отфильтровывали раствор через другой диск из стекловолокна.
Промывали фильтр 6 раз 5 мл охлажденной во льду 10% ТХУ, затем добавляли 5 мл 95%-ного этанола. Высушивали оба фильтра под лампой накаливания. Помещали фильтры в сцинтилляционные флаконы.
Просчитывали радиоактивность в сцинтилляционной жидкости на основе толуола. На первом фильтре измеряли общую радиоактивность в пробе, на втором - радиоактивность, включенную в нуклеиновые кислоты.
С помощью этой процедуры количественно осаждаются нуклеиновые кислоты длиной 20 нуклеотидов.
Ник-транслированную ДНК разделяли от невключившихся ёНТФ на микроколонке с сефадексом G-50 обычной хроматографией. Приготовляли колонку с сефадексом G-50 в подходящей 5 мл стеклянной пробирке.
Промывали колонку несколькими объемами буфера ТЕ (рН=8,0). Наносили на колонку пробу ДНК (в объеме 200 мкл). Промывали пробирку, в которой находилась ДНК, приблизительно 100 мкл буфера ТЕ (рН=8,0) так, чтобы скорость потока составляла около 0,5 мл/мин.
В Эппендорфовские пробирки собирали 12-15 фракций (по 0,5 мл). ДНК не включается в гранулы сефадекса и выходит в исключенном объеме (обычно составляющем 30% общего объема колонки). Таким образом, первый пик радиоактивности дают нуклеотиды, включенные в ДНК, а следующий за ним пик - свободные Н ёНТФ. Процент Н сІНТФ, включившихся в ДНК, определяли путем изменения радиоактивности пробы до и после гель-фильтрации.
Собирали радиоактивные фракции, составляющие первый пик, и хранили их при минус 20С.
В находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносили следующие реактивы: ДНК 1мкг, 10-кратный.объем буфера для ник-трансляции (ЮхНК) - 5 мкл, 5 мкл холодных дезоксинуклеозидтрифосфатов; вода до конечного объема 50 мкл, 0,4 мМ bio-7-dATP 2,5 мкл, ДНКаза 1 (0,4-1,0 нг/мкг ДНК) 2 мкл, ДНК-полимераза 1 (4 ЕД) 2 мкл. Буфер ЮхНК содержал: 500 мМ трис-HCl, рН 7,6; 50 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанол.
Все компоненты перемешивали, аккуратным встряхиванием пробирки и инкубировали 2 часа при 15С. Реакцию останавливали, добавлением 5 мкл стоп-буфера (300 мМ этилендиамитетрауксусная кислота-ЭДТА, рН 8,0). Невключившиеся нуклеотиды удаляли хроматографией на сефадексе, как описано в разделе 2.2.6.
Разработка тест-систем и технических средств для проведения анализа в нестационарных условиях
Еще в 30 годы прошлого столетия микробиологи много внимания уделяли изменчивости микроорганизмов и их морфологической гетерогенности, возникающей при воздействии различных факторов окружающей среды. Выражением изменчивости является хорошо известное явление L - трансформации бактерий. Многие микроорганизмы в ответ на разные стрессовые условия окружающей среды могут терять способность расти на средах, на которых их обычно культивируют, но при этом оставаться жизнеспособными. Например, кишечная палочка после инкубации в морской воде сохраняет свою жизнеспособность, хотя и теряет способность к образованию колоний на культивируемых средах. Подобное состояние получило название «не культивируемого», а сами бактерии находящиеся в этом состоянии получили название «не культивируемых форм». При смене неблагоприятных условий существования клетки может происходить рекультивируемость или реверсия, то есть бактерии вновь приобретают способность к размножению на привычных для них средах. Количество видов бактерий, для которых обнаруживается способность к переходу в не культивируемое состояние, постоянно растет.
Многим патогенным бактериям, имеющим в своем жизненном цикле длительную сапрофитную фазу существования, способность к переходу в L формы обеспечивает возможность переживания неблагоприятных условий внешней среды в межэпизотические и межэпидемические периоды. Клетки микробов, уменьшенный размер и кокковидную форму. При этом показано наличие действующих метаболических систем, а именно способность к восстановлению активных красителей, что свидетельствует о функционировании дыхательной и электронно-транспортной цепей. Включение меченного тимидина указывает на активность систем биосинтеза нуклеиновых кислот и белка. Электронно-микроскопические исследования показали более высокую плотность цитоплазмы не культивируемых форм бактерий, сокращения числа рибосом и размытость контуров ядерной области.
В настоящее время для определения клеток, находящихся в не культивируемом состоянии, разработан метод при окрашивании их акридиновым оранжевым с последующей флуоресцентной микроскопией. В последнее время для выявления не культивируемых форм стали применять молекулярно-генетические методы.
При разработке метода дифференциальной диагностики различных форм бактерий на основе ДНК-гибридизации создавали модельные системы получения L-форм.
Культуру S. aureus высевали «газоном» на мясопептонный агар (МПА), затем наносили диски с антибиотиками различных групп в разведениях от 12,5 мкг/мл до 600,0 мкг/мл и инкубировали при температуре 37С в течение 18-24 часов. При аналогичных условиях проводили опыт с выращиванием бактерий в полужидком агаре на мембранных ацетатцеллюлозных фильтрах. Полученные данные приведены в таблице 14.
Из представленных в таблице 14 данных видно, что воздействие различных антибиотиков на культуру S. aureus вызывает в зависимости от дозы бактериостатический или бактерицидный эффект.
При исследованиях в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) популяции S. aureus, не подвергшихся воздействию антибиотиков (контроль), было установлено, что колонии представлены многослойными структурами, состоящими из клеток, находящихся в ассоциации. Клетки S. iiuieus в популяции имели одинаковые размеры и форму, что свидетельствовало о нахождении их в S-форме (рис.8). Воздействие антибиотика на популяцию бактерий вызвало изменение морфологии клеток. Выявлены шаровидные клетки протопластного типа, свойственные грамположительной микрофлоре, а также клетки в различных стадиях L-трансформации, включая L-формы (элементарные тела) (рис. 9).
Аналогичные данные по получению L-форм бактерий были показаны и для других групп микроогранизмов. При этом достижение эффекта перехода к гетероморфному росту также наблюдалось при воздействии различных концентраций антибиотиков.
Для изучения процесса L-трансформации с последующей реверсией клеток S. aureus использовали антибиотики различных групп.
На твердую питательную среду помещали систему двойных мембранных ацетатцеллюлозных фильтров с различным диаметром пор (0,45 мкм, 0,22 мкм). На верхний фильтр наносили культуру S. aureus с различными разведениями антибиотиков в полужидком агаре и оставляли на 24 часа при температуре 37С.
Бактериальные клетки после действия антибиотиков переходят в стадию гетероморфного роста и L-трансформации. Трансформированные клетки, имеющие меньшие размеры и поврежденную клеточную стенку, проходят через поры верхнего фильтра, но удерживаются на нижнем, в результате чего происходит разделение вегетативных клеток и клеток в стадии L-трансформации.
Исследование образцов препаратов из верхних фильтров показало наличие клеток, находящихся в стадии гетероморфизма и на разных этапах L-трансформации: клетки протопластного типа, гигантские клетки, L-формы. При изучении образцов препаратов из нижних фильтров были выявлены преимущественно клетки в стадии L- трансформации, включая L-формы размером 0,25-0,70 мкм (рис. 10).
При воздействии ампициллина, гентамицина, кефзола и актиномицина в концентрациях от 12,5 до 50,0 мкг/мл наблюдали реверсию клеток на нижнем фильтре после инкубирования на обогащенной питательной среде при температуре 37 С через 24 часа; при воздействии ампициллина и гентамицина в концентрациях от 100 до 600 мкг/мл реверсию наблюдали через 36 - 48 часов инкубирования, что свидетельствовало о бактериостатическом действии данных антибиотиков. При этом на фильтрах методом сканирующей электронной микроскопии были выявлены клетки в стадии гетороморфизма и бактерии с морфологическими признаками, свойственными не измененным клеткам - ревертантам (рис. 1 1).
