Введение к работе
Актуальность проблеми. Всесторонним изучением возбудителя туберкулеза неоспоримо доказаны многообразие форм его существования, большая вариабельность морфологии (полиморфизм) и широкий диапазон изменчивости его биологических свойств (плеоморфизм).
Многими исследователями описаны многочисленные морфологические варианты микобактерий, отличающиеся от типичной палочковидной форлы,- среда которых особое вншлание заслуживают бактерии,. дефектные по.клеточной стенке - Л-формы (З.Н.Кочемасова с соавт., 1980; З.С.Земскова, И.Р.ДорозккоЕа, IS84).
Повреядения, связанные с дефектом или частичной утратой кле-точнЬй стенки, вызывают глубокие морфологические и функциональные изменения микроба, при этом он сохраняет способность длительно персистировать, а такие реверсировать в исходный микробный вид. Факторы индукции Л-форм микобактерий многочисленны, они представлены различными химическими соединениями, биологическими агентами, физическими воздействиями.
Однако, отсутствие достаточных знаний о роли факторов индукции Л-форм и сравнительного анализа их Л-трансформирувдего действия на возбудителя туберкулеза не позволяет пока оценить истинное значение этих форм в эпизоотическом процессе и эффективности противотуберкулезных мероприятий.
Вместе с тал, роль факторов шщукцшг и сравнительный анализ их Л-трансформирувдего действия с ка:.щым годом приобретает в инфекционной патологии все большее значение в связи с расширением и углублением наших представлений о механизме образования и тех структурных изменениях, которые претерпевают клетки в процессе их Л-трансформапии (Н.Л.Вершилова с соавт., 1972; В.Я.Тимаков, Г.Я.Каган,'1973; П.А.Триленко, IS73, 1976; А.И.Кузин, 1977, I960;
П. А. Баку лов, Ї.Я.Зеленцова, I98L; II. Г. Кириленко, 1080; П.Е.Савченко, I9Su; :.i.A.JatTiHii, I9Gu; Б.П.Урбан, I28l , І2С-І; В.С.Федосеев, ІССь, 1281, ISS5, 1983; СВ.Прозоровский с соавт., 1981; А.Л. Щетшш, 1981; Т.П.Байторякова, 1983; Б.Ф.Керимглнова, 1991).
В последние годы с изменением патоморфологической картины туберкулеза, сочетающей как специфические, так и неспецифпческие морфологические реакции с выраженным аллерпіческшл компонентом и перспстенцией возбудителя в Л-фюрме, все большее значеіше приобретают методы лабораторной диагностики (І.І.І.Ї. Авербах с соавт., 1968; Б.Е.Кцорннг, I97S; J.Н.Левина, 1981; II.В.Коваленко, I9S3, 1969). Поэтому разработка наделсных методов и средств диагностики туберкулеза по-про;:лему остается ЕаглоідіеД задачей исследователей. Оп-рсдалошшй интерес в этой связи представляет пг-мунофлщресцентный метод, пироко применяемый в различішх областях пмглунолопш, микробиологии, по ненашсшшш датлюго пршленения в лабораторной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных Ш1В0ТІШХ.
Существенным его преимуществом является обнаружение и идентификация искомого антигена среди других смошаннгх антигенов. 11м-мупоф.іюоресцсптнг:" метод мо';;ет быть использован для обнаружения различных корпускулярных пли растворимых антигенов при условии их фиксации па поверхности пли внутри клеток. Чувствительность его колеблется от І-ІС - 5"1С микр.клеток в I мл, в то время как обычные ііміупологичоекнє реакции требуют содер.тхишя в I мл взвеси .о'Іо" - 2,o"ICJ мпкр.клеток (ь.II.Левина, I9G2; Лочен, 1-ї-і; У. -оррп, ..Ісймер, I ?!).
...ель л задачі: исследований, отсутствие началшх методов віив-ления п :ласспфш:ацип Л-трансформировапных вариантов млкобактерпй, а таїпс ограниченность научных сведении о патоморфозе Л-форм побудит пас "роиести комплексное изучение Л-форм туберкулеза
(индукция, стабилизация, реверсия, микроскопическая*структура) и на основе полученных данных разработать научные рекомендации по диагностике я профилактике туберкулеза сельскохозяйственных :лі-вотных.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
изучить условия и некоторые закономерности Л-трансформации ып-кобактерий туберкулеза под действием поверхностно актнвішх веществ, культуры клеток в организме лабораторных и сельскохозяйствен-' кнх "сивотных;
определить специфичность и диагностическую ценность непрямого метода іакунофсторесценции для индикащш и идентификации бактериальных форм туберкулеза и Л-трансфорглированных вариантов мико-бактериіі;
выяснить методами патоморфологического и микробиологического исследований связь тканевых проявлений с Л-формами микобактерий туберкулеза;
установить возможность .пспользовшшя непрямого метода иммуно-ушаоресценцші параллельно с культуральным для пндикацші и идентификации мпкобактерий в биоматерпале ?жвотішх из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.
Научная новизна. Установлено, что Л-трансфорыация микобак-терш": туберкулеза - закономерный процесс, происходящий под действием поверхностно активных веществ (лизоцпма, глицина), в культуре клеток макрофагов и в организме тавотных, способствующий обеспечению сохранности и разнообразию Их биоморфологии.
Разработан способ получения Л-форм микобактерий в культуре перптонеаіьннх макрофагов белых мыией.
Получены новые данные, расширяющие представления о динамике
її характере морфологической и (функциональной трансформации шко-бактерий in vitro u in vivo . Показана возмачшость явления трансформации микобактерий БЦЕ в организме вакцинированных телят, способность их длительно персистироЕать в организме.
Установлено, что несмотря на дефект клеточной стенки, Л~фор-мы- микобактерий туберкулеза сохранили антигеїіную специфичность и серологическую активность, последняя была несколько ниже, чем у исходной бактериальной культуры. Л-формы, полученные экспериментальным путем в зависимости от факторов индукции, отличаются по антигенному составу. У Л-вариантов, полученных in vitro , в достаточной мере сохранялась клеточная стенка, а у Л-форм, полученных in vivp,отмечалось значительное нарушение клеточной стен--ки, кдк следствие этого - преобладание антигенов цитоплазмы и ци-топлазматической мембраны.
Установлено, что естественный патоморфоз ответных туберкулезных реаїций на введение в организм Л-форм микобактерий протекает по неспецифическому пути, а степень неспецифических изменений зависит от глубины изменчивости персистируыцего в организме возбудителя.
В условиях эксперимента доказано, что срок появления туберкулезных антигенов и их первоначальный уровень зависит от био-. морфологических форм возбудителя туберкулеза. В дальнейшем с возрастанием длительности заболевания эта зависимость нивелируется. Наиболее чувствительным и специфичным из испытанных методов серодиагностики туберкулеза оказывается непрямой метод флюоресцирующих антител, позволяющий с большой достоверностью диагностировать заболевание морских свинок через сутки после заражения независимо от характера биоморфологии возбудителя туберкулеза.
Установлено, что реакция шлиунофлюоресценции обладает высо-
кой специфичностью в отношении видовой идентификации бактериальных и Л-форм микобактерий, как лабораторных штаммов, так и культур, полученных .из биоматериала больных туберкулезом лшвотных. Непрямая иммунофлюоресценция позволила установить локализацию антигенов в клетке Л-форм,-
Доказано на разнообразном секционном материале, что использование непрямой таднофлюоресценции в комплексе с методом посева повышает специфичность и информативность микробиологической диагностики туберкулеза, обеспечивает надежный контроль за эпизоотическим состоянием стад по туберкулезу.
В процессе комплексного использования рутинного метода посева и непрямой шлмунофлюоресценции уточнена частота и соотношение выделения бактериальных и Л-форм микобактерий туберкулеза в зависимости от эпизоотического состояния хозяйства по туберкулезу.
ІЄОДЄ.ТДЧИ.Ш К .ПРаштасШ знддюсдь.,, Результаты исследования Л-трансфорлации мпкобактерий туберкулеза, свойств Л-форм и реверсии их в бактериальную форму, позволяют подойти к этому явлению с более широких общебиологических позиций и сделать вывод, что для микобактерий туберкулеза Л-трансформация вполне закономерна и новые, научные факты могут быть использованы для целевой программы'научных изысканий, а такие практических.критериев оценки и прогнозирования эпизоотической ситуации по туберкулезу как в отдельном хозяйстве, таї! и в целом по региону. Полученные данные в совокупности с материалами различішх научных учреждений послужили основанием для разработки ряда научных и практических рекомендаций ь наставлений по диагностике и профилактике туберкулеза тлвотных с учетом возможности Л-трансформа-ции возбудителя туберкулеза.
.-8-
Аптобаиия габоты. Материалы работы долопеїш и обсудцены на заседаниях Ученого совета ДальЗНИШ (1886-1992); Амурской областной научной конференции "Ветеринарная наука на службе производства" (Благовещенск, 1587); зональной научной конференции "Профилактика и ликвидация основных болезней сельскохозяйственных животных" (Благовещенск, 1989);!зональной научно-практической кон-ферепции "Проблемы ветеринарии Приморского края" (Владивосток, 19Э0); Всесоюзных координационных совещаниях исполнителей НИР по туберкулезу страны (Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990); Всероссийском координационном совещании исполнителей ІШР по туберкулезу страны (Омск, I9S3 ); на научной конференции, посвященной 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики туберкулеза и паратуберкулеза ШЭВ (ІЛосква, 1922); научной сессии общего годичного собрания Дальневосточного отделения БАСХБИД (Хабаровск, IS90); научной сессии общего годичного собра-иия Дальневосточного, .отделения. PAJXH (Хабаровск, 1992, 1993 ).
Публикация результатов исолепованшт. По теме диссертации опубликовало 22 работы в.сборниках научных трудов J0 ВАйХШД, ДБО РАиХН и бюллетене ЕИЭЕ, куриалах "Ветеринария", "Проблемы туберкулеза", материалах научных конференций и в других научно-производственных изданиях.
Объем и отруцтт/ра, диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописи, иллюстрирована 33 таблицами и 56 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, результатов"собствеи-ішх исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения. Список литературы включает 637 источников, е том числе '359 отечественных и 278 иностранных. Текстовая часть диссертации составляет 327 страниц.
Основний поло-.енпя. енносимно на зашптт?.
- характеристика морфологических и биологических свойств Л-форм
микобактерий туберкулеза, методы, средства их получения и выделения;
Л-трансформация микобактерий туберкулеза с общебиологических позиций;
специфичность и диагностическая ценность непрямого метода им-мупофліооресцениди для выявления и идентификации бактериальных. и Л-трансфорлировашшх вариантов микобактерий туберкулеза;
патоморфологическое, серологическое и аллергическое исследова-.ние на туберкулез при экспериментальной инфекции у лабораторных ;яивотных;
патоморшологическое, микробиологическое и иммунофлюоресцентное исследование биоматериала от кивотных, реагирующих на туберкулин, из хозяйств с различной эпизоотической характеристикой.
