Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Этиология эндометритов у коров 6
1.2. Профилактика и лечение эндометритов у коров— —12
1.3. Антагонистическая активность некоторых штаммов симбионтных микроорганизмов по отношению к условно - патогенной микрофлоре при эндометритах 20
1.4. Применение пробиотиков для профилактики и лечения эндометритов - — 29
1.5. Экономические потери при эндометритах у коров 33
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы, методы и объем проведенных исследований 36
2.2. Микрофлора половых органов клинически здоровых коров 44
2.3. Условно - патогенные микроорганизмы при эндометритах 58
2.4. Селективный отбор штаммов симбионтных микроорганизмов с учетом антагонистической активности и разработка из них бактериального препарата 67
2.5. Испытание профилактического и лечебного действия полученного препарата- - 84
2.6. Экономическая эффективность применения препарата— 91
ОБСУЖДЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 102
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - 106
ПРИЛОЖЕНИЕ - - 131
- Этиология эндометритов у коров
- Материалы, методы и объем проведенных исследований
- Селективный отбор штаммов симбионтных микроорганизмов с учетом антагонистической активности и разработка из них бактериального препарата
Введение к работе
Актуальность темы: В современных условиях ведения молочного животноводства эндометриты являются одной из главных причин, сдерживающих повышение молочной продуктивности у коров. За последние годы проведено много важных исследований по изучению послеродовых эндометритов, однако, отдельные аспекты этой сложной проблемы все еще окончательно не решены.
Так, по-прежнему сохраняется высокая заболеваемость коров эндометритами. По мнению В.Ф. Воскобойника и Г.Г. Козловой (1991) в крупных хозяйствах заболевает 76 % отелившихся коров. Экономический ущерб на одну заболевшую корову составляет, по данным В.Ф. Воскобойника (1985) 112,12 рублей в ценах 1985 года. Исходя из этого, совершенствование мер профилактики и лечения эндометритов является актуальной задачей.
Пробиотические препараты обладают комплексным действием при отсутствии токсичности и побочных эффектов, они не вызывают привыкания микрофлоры. Указанные препараты не оказывают негативного воздействия на качество молока. В современных экономических условиях пробиотики привлекают внимание также сравнительно невысокой стоимостью. Все это открывает возможности для их широкого применения.
Целью настоящей работы является разработка бактериального препарата из симбионтных микроорганизмов для профилактики и лечения эндометритов у коров. В соответствии этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить микрофлору половых органов клинически здоровых коров с целью выделения симбионтных микроорганизмов.
2. Выяснить видовой состав и свойства условно-патогенных микроорганизмов при эндометритах у коров.
3. Произвести селективный отбор штаммов симбионтных микроорганизмов с учетом антагонистической активности по отношению к условно-патогенным микроорганизмам при эндометритах у коров.
4. Разработать бактериальный препарат из симбионтных микроорганизмов.
5. Испытать профилактическое и лечебное действие полученного препарата.
6. Дать оценку экономической эффективности профилактического и лечебного действия бактериального препарата.
Научная новизна: Проведено углубленное изучение микрофлоры половых органов здоровых и больных эндометритом коров. Выделены симби-онтные микроорганизмы от здоровых животных. Выяснен видовой состав и свойства условно - патогенных микробов при эндометритах у коров.
Изучена антагонистическая активность штаммов симбионтных микроорганизмов по отношению к условно-патогенной микрофлоре.
Разработан бактериальный препарат из симбионтных микроорганизмов, обладающий профилактическим и лечебным действием при эндометритах. Определены показатели экономической эффективности указанного препарата.
Разработаны технические условия и технологическая инструкция по производству бактериального препарата.
Практическая ценность работы: Предложен новый пробиотический препарат под названием «Спорметрин» для профилактики и лечения эндометритов у коров.
Реализация результатов исследований: Профилактическое и лечебное действие препарата испытано в четырех крупных животноводческих хозяйствах: СХПК «Колхоз Высоковский», СХПК «Племзавод Майский», СХПК «Ильюшинский» Вологодской области и в НПХ Холмогорской опытной станции животноводства и луговодства Архангельской области. Разработано наставление по испытанию препарата в широких производственных условиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изыскание симбионтных микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами по отношению к патогенной микрофлоре при эндометритах.
2. Видовой состав и свойства условно-патогенной микрофлоры при эндометритах у коров.
3. Разработка бактериального препарата из симбионтных микроорганизмов для профилактики и лечения эндометритов.
4. Испытание профилактического и лечебного действия полученного препарата.
5. Разработка технических условий, технологической инструкции по изготовлению бактериального препарата и наставления по испытанию его в широких производственных условиях.
6. Определение показателей экономической эффективности применения препарата.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены на первой (май 1999 г.) и второй (июнь 2000 г.) межвузовских научно-технических конференциях молодых ученых (Вологда-Молочное), на ежегодных (1999 и 2000 г.г.) научно-методических конференциях факультета ветеринарной медицины ВГМХА.
Внедрение: Разработанный препарат применяется с положительным эффектом в четырех хозяйствах Вологодской и Архангельской областей.
Публикации: По теме диссертации опубликованы четыре научные работы.
Этиология эндометритов у коров
Изучение эндометритов у животных проводится длительное время. При этом ряд исследователей, в частности Goetze (1930), М.В. Мюльберг (1937), А.А. Сысоев (1965), В.П. Парусов (1974) считают, что у здоровых коров слизистая оболочка матки стерильна.
А.А. Осетров и соавт. (1966) приводят данные о том, что даже краниальная часть влагалища в период течки и охоты у здоровых коров практически свободна от микробов. Б. Муртазин (1971) сообщает, что у здоровых нормально отелившихся коров только в единичных случаях в начальной стадии инволюции матки из цервикальной слизи были выделены Вас.subtilis и E.coli communis. В дальнейшем цервикальная слизь становилась стерильной.
Однако, Beller (1925) отмечает, что у клинически здоровых коров в матке можно обнаружить микробов. К.П. Чепуров (1950), И.Ф. Заянчков-ский (1957), Н.В. Румянцев (1958) сообщают о выделении различных микроорганизмов из матки здоровых коров. Williams B.L. et all. (1988) при исследовании образцов маточной слизи обнаружили у 65 % здоровых коров от одного до восьми видов микроорганизмов в матке.
А.К. Сеглинь (1971), И.Н. Зюбин, М.Ф. Зюбина (1982), а также Noakes D.E. (1982), (1983) приводят данные о наличии разнообразных микроорганизмов, в том числе Вас. subtilis, Вас. megaterium и Вас. mycoides в матке коров после отела. Они считают, что это обусловлено случайным попаданием микроорганизмов из внешней среды. С завершением инволюции матки (через четыре-пять недель после родов) количество микроорганизмов постепенно уменьшается, и затем они исчезают. По мнению Н.Н. Михайлова и соавт. (1967) обнаружение микроорганизмов в матке наблюдается в 20-30 % случаев и свидетельствует о субклиническом течении эндометрита. Б. Муртазин (1971) поддерживает эту точку зрения и приводит данные о том, что такое состояние часто сопровождается бесплодием.
Б.Л. Белкин и соавт.(1988) при исследовании микрофлоры матки здоровых глубокостельных коров обнаружили лишь сапрофитные стрептококки Str.saprophyticus.
Приведенные данные не позволяют сделать какого-либо определенного вывода о составе микрофлоры половых органов здоровых коров, а также о наличии или отсутствии в ней штаммов симбионтных микроорганизмов.
Что касается микрофлоры матки коров, больных клинической формой эндометрита, то по этому вопросу проведены многочисленные исследования.
По данным Н.Ф. Мышкина (1943), П.А. Волоскова (1950), (1965), Mar-bach R. (1955), Benesch F. (1957), Archibald J. et all (1973), Е.П. Кремлева (1974), СП. Хомина (1976), В.П. Гончарова, В.А. Карпова (1991) основным этиологическим фактором возникновения эндометритов является инфицирование матки условно-патогенными микроорганизмами. В состав таких микроорганизмов авторы включили стрептококки, стафилококки, протей, кишечную и синегнойную палочки.
И.А. Бочаров, и соавт. (1952) выделили от больных коров кишечную палочку, стрептококки, диплококки и синегнойную палочку. Обнаружение в матке одного вида микроорганизмов отмечено у 12 коров, нескольких видов - у 20 коров.
Н.И. Соколов (1960) также отметил наличие в матке нескольких видов условно-патогенных микробов.
Я.Г. Губаревич, А.С. Терещенков (1969) обнаружили при остром после 8
родовом эндометрите следующие микроорганизмы: Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Proteus spp., E.coli, Bac.subtilis, Cl.oedematiens и Cl.perfringens.
Е.П. Кремлев, H.E. Жульянова (1969) сообщили о выделеных ими грибах Asp.fumigatus, Asp.niger, Asp.flavus, как о причине возникновения абортов и воспалительных процессов гениталиев коров.
П.Н. Ли, В.Н. Баринов (1969) привели аналогичные данные о влиянии грибов Candida albucans.
Этиологическая роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии эндометритов была доказана на обширном материале в работах Н.Н. Михайлова, и соавт. (1970). В состав условно-патогенной микрофлоры ими были включены E.coli, Staph.albus, Staph.flavus, Staph.aureus, Salm.dublin, Salm.paratyphi, Salm.abortus ovis, Bact.proteus vulgaris, Bact.pyocyaneum, Corynebact.pyogenes, Str.pyogenes. Несколько позднее Н.Н. Михайлов, Б. Муртазин (1971), Б. Муртазин (1971), Н.Н. Михайлов (1976), Н.Н. Михайлов, И.Я. Чистяков (1978) выделили от коров при эндометритах также Bact.proteus rettgeri, Bact.proteus morganii, Bact.proteus mirabilis, Diplococcus septicus, Bact.acrogirosum, Str.haemolyticus, а также энтерококки, дрожжевые и плесневые грибки. Указанные авторы отмечают, что ассоциации вышеперечисленных микроорганизмов имеют повышенную патогенность для лабораторных животных и более устойчивы к действию антибиотиков.
А.К. Сеглинь (1971) также приводит подробные данные о составе микрофлоры матки коров после отела. Он выделил следующие микроорганизмы: E.coli communis, E.coli communor, E.paracoli vulgaris, E.paracoli 1-5, Str.faecalis, Str.pyogenes, Str.haemolyticus, Bact.proteus vulgaris et zopfii, Bact.cocciformis, Bact.subtyphosum, Bact.vaginalis, Bac.iridens, Bac.filiformis, Bac.gasoformans, Вас.simplex, Bac.thermophilis, Bac.esterificans, Bac.thermocellulolyticus, Urobact.amilovarum, Urobact.hesmogenes, Uro-
bact.annuliformis, Lactobacillus berolinensis. Все выделенные микроорганизмы автор отнес к условно - патогенным.
Criffin J.F.T. et all (1974) отводят главную роль в возникновении эндометритов Corynebacterium pyogenes.
А.А. Бернатонис и соавт. (1975) выделили из 51 пробы при эндометрите у коров стафилококки в 34 % проб, стрептококки - в 28 %, кишечную палочку - в 20 %, протей - в 7 % , синегнойную палочку - в 3 %, споровую почвенную микрофлору - в 8 % проб.
И.Н. Зюбин, М.Ф. Зюбина (1982) при остром и хроническом эндометрите в 86,75 % случаев выделили следующие условно-патогенные бактерии и грибы: E.coli, Staph.albus, Staph.aureus, Staph.pyogenes, Bac.subtilis, Proteus vulgaris, Bact.pyocyaneum, Candida albucans, Candida tropicalis, Asp.fumigatus, Mucor racemosus, Mucor pusillus, Fusarium graminearum, Lichteimia corymbitera.
Из них 77,4 % штаммов обладали высокой патогенностью для белых мышей. При этом особенно высокая вирулентность была обнаружена у ассоциаций бактерий и грибов. В 11,28 % исследованных проб не было выявлено микроорганизмов.
Bretzlaff K.N. et all (1982) сообщают, что от больных коров были выделены E.coli в 69,4 % случаев.
Carvalno M.R. et all (1982) выявили роль E.coli, Staph.spp., Corynebact. pyogenes в этиологии эндометритов у коров.
А.С. Терещенков (1983) наряду с другими микроорганизмами выделил также анаэробные стрептококк и диплококк.
Messer S. et all (1984) сообщают, что анаэробные микроорганизмы изолированы от всех 11 коров с признаками послеродового эндометрита.
Е.Т. Тришкина, Л.Х. Галушко (1985) произвели серотипирование культур E.coli, выделенных от больных коров. Типируемость культур составила 71 %, в том числа серогруппа 0139- 25 %, 0115- 20 %, 0101 и 0102- 10 %. Из них 84 % культур были патогенны для белых мышей.
В.Ф. Шаталов и соавт. (1985) установили, что максимум микробной об-семененности матки достигается на седьмой день, а минимум - на 15-20-й дни от начала заболевания.
Г.М. Андреев, Н.И. Мирон (1986) обнаружили при остром катаральном и гнойно-катаральном эндометрите в 42 % проб E.coli, Proteus vulgaris и Corynebact.pyogenes.
Slee R.J. (1985), Bretzlaff К. (1987), El-Azab M.A., Whitmore H.L. (1988) отмечают этиологическую роль Corynebact.pyogenes и Bacteroides spp. в патогенезе эндометритов.
Noakes D.E. et all (1989) сообщают о выделении от больных коров Согу-nebact. pyogenes, E.coli, Proteus mirabilis, Proteus sp., Bacteroides melanino-genicus, Citrobacter kosen, Klebsiella aerogenes, Klebsiella oxytoca, Clostridium sp., Fusobacterium vanium, Fusobacterium necroforum, Enterobacter cloacae, Bac.fragilis, Micrococcus sp.
Cohen R.O. et all (1995) удалось выделить Actinomyces pyogenes из матки коров с задержанием последа и эндометритами.
Следует отметить также сообщение В.И. Кулакова и соавт. (1996) о том, что у 70 % больных послеродовым эндометритом женщин из матки выделены облигатные анаэробы (Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp.).
По мнению отдельных исследователей условно-патогенные микроорганизмы являются хотя и главным, но не единственным фактором, обуслов-ли-вающим возникновение эндометритов. Так, В.Ф. Шаталову и соавт. (1985) в опыте не удалось заразить коров условно-патогенными бактериями, при благоприятных условиях кормления и содержания.
В качестве факторов, предрасполагающих к развитию эндометритов, Т.Е. Григорьева (1988), (1991) называет травмы слизистой оболочки матки при трудных родах, задержании последа, выпадении и субинволюции матки. Кроме травматических факторов определенное значение имеет снижение резистентности организма вследствие неполноценного и недостаточного кормления, что обусловливает нарушение кислотно-щелочного равновесия, минерального обмена, в частности кальциево-фосфорного соотношения, дефицит витаминов А, Д, Е.
По мнению К.А. Елпакова (1961) слабые потуги и задержание последа явились основными предпосылками развития эндометритов, причем наиболее часто эндометриты возникали у коров, при пониженном содержании в крови гемоглобина, сахара, каротина, и резко повышенном - ацетоновых соединений.
По данным И.Ф. Заянчковского (1962) из учтенных автором 5739 коров с задержанием последа переболели эндометритом 47,8 %, из них 20,9 % остались бесплодными.
Н.И. Краснов (1962) приводит данные о том, что из 184 коров у 167 (90,8 %) эндометриты возникли на почве задержаний последа, травм, задержания лохий при выраженной атонии матки.
Е.В. Ильинский (1968) также сообщает, что занос патогенной микрофлоры в матку может происходить из вымени и кишечника животных при наличии в них воспалительных очагов.
A.M. Минаев (1971) отмечает в числе других причин неправильное и несвоевременное лечение при задержании последа и выпадении матки.
Duncanson G.R. (1980) утверждает, что вероятность развития эндометрита выше у более старых коров и при высокой молочной продуктивности.
Ruder С.A. et all (1981) установили, что дефицит протеина в рационе является фактором риска при эндометритах.
Wilson G.D.A. (1984) выявил положительную корреляцию между субинволюцией матки и развитием эндометритов. Markusfeld О. (1985) установил эндометрит у 80 % коров с кетонурией.
Harrison J.H. et all (1986) обнаружили, что введение селена и витамина Е в рацион сухостойных коров уменьшает риск развития субинволюции матки и эндометрита.
Emanuelson U. et all (1993) подтверждают данные предыдущих авторов о том, что задержка плаценты и дистония матки увеличивают риск развития эндометритов.
Lowder M.Q. (1993) в своей работе приводит множество факторов, способствующих развитию эндометрита. Это задержка плаценты, антисанитарное состояние окружающей среды, нарушенный эндокринный баланс (в том числе высокая концентрация простагландинов в крови), неправильное кормление, стрессы, гипокальцемия, кетоз, мертворождения, аборты, атонии и выпадения матки.
Материалы, методы и объем проведенных исследований
Работа выполнялась с 1998 по 2000 года на кафедре эпизоотологии и микробиологии факультета ветеринарной медицины ВГМХА, в бактериологическом отделе Белозерской районной ветеринарной лаборатории и в хозяйствах Вологодской и Архангельской областей. Отбор проб биоматериала от коров и испытание профилактического и лечебного действия полученного препарата производилось на фермах восьми хозяйств: "Дружба", "Колос", "Имени Степанова", "Крестьянское хозяйство Губанова В.И." Белозерского района, "Колхоз Высоковский", "Племзавод Майский", "Ильюшинский" Вологодского района, а также в НПХ Холмогорской опытной станции животноводства и луговодства Архангельской области.
Диагностика эндометрита осуществлялась путем внешнего осмотра и ректального исследования коров. Признаками заболевания служило выделение измененных лохий, а в дальнейшем и характерного экссудата из матки во время лежания, при натуживании и ректальном массаже матки. При ректальном исследовании наблюдалось увеличение матки, ее дряблость, отечность, слабая сократимость, опущение матки в брюшную полость. У некоторых животных наблюдалось значительное ухудшение общего состояния, снижение аппетита, угнетение, повышение температуры на 1-2 С. Как правило, окончательный диагноз ставился не ранее, чем через пять-шесть дней после отела.
По характеру клинических признаков заболевание эндометритом у животных подразделялось по методике Murray R.D. et all (1990) на три степени - легкую, среднюю и тяжелую. При этом учитывалось общее состояние, характер экссудата и данные ректального исследования матки.
Критерием клинического выздоровления служило полное прекращение выделения экссудата, либо выделение небольшого количества прозрачной слизи, при условии возвращения матки к нормальным размерам и восстановлении ее сократительной деятельности.
Отбор проб влагалищной и цервикальной слизи осуществлялся по методике Н.Н. Михайлова и соавт. (1967). Шприцы-катетеры и пробирки с физиологическим раствором стерилизовались автоклавированием при 1,5 атм. в течение 30 минут, влагалищное зеркало - обработкой спиртом с последующим фламбированием.
В стерильный шприц-катетер для искусственного осеменения набира-лось 2 см стерильного физиологического раствора. Наружные половые органы коровы обмывались теплым раствором марганцевокислого калия 1:1000, после чего в них вводилось стерильное влагалищное зеркало с осветителем.
Для получения проб цервикальной слизи шприц-катетер вводился под визуальным контролем в шейку матки на глубину 3-5 см и впрыскивался физиологический раствор, затем этот раствор насасывался обратно. Такая манипуляция повторялась три раза, после чего шприц-катетер извлекался, а его содержимое переносилось над пламенем спиртовки в стерильную пробирку, содержащую 5 см физиологического раствора. Пробирки закрывались резиновыми пробками и доставлялись в лабораторию в течение шести часов.
Пробы влагалищной слизи получали тем же способом, но шприц-катетер не вводился в шейку матки, а делался смыв со складок краниальной части влагалища.
Выделение микроорганизмов из биологического материала осуществлялось путем посевов на питательные среды. Пробы от здоровых коров высевались на мясопептонный бульон, а для выделения молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий - также на (стерильное обезжиренное молоко, капустный бульон по прописи Е.И. Квасникова, О.А. Нестеренко (1975) и на среду Блаурока (бульон и агар столбиком).
Пробы от больных коров высевались на мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среды Эндо, Плоскирева, Китта-Тороцци и агар Сабуро с -. пенициллином - для выделения плесневых грибов. Перед посевом из каждой пробы делался мазок с окраской по Граму и подвергался микроскопи-рованию.
Для выделения чистых культур использовался метод серийных разведений и дробного посева на агаризованные среды. Культуры микроорганизмов, выделенные от здоровых коров, пересевались дробно на мясопептонный агар, капустный агар и капустный агар со спиртом по методике Е.И. Квасникова, О.А. Нестеренко (1975)- Культуры, полученные от боль Л Г ных коров, пересевались на мясопептонный агар, кровяной мясопептонный агар, агар Эндо, а со среды Китта-Тороцци - на сахарно-кровяной агар Цейслера (в эксикаторе). Из выросших колоний выделяли чистые культуры, у которых изучали морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, биологические свойства, изменчивость, а также определяли подвижность, производили измерение.
Морфологические свойства изучались путем микроскопии окрашенных мазков, сделанных с жидких и плотных питательных сред у культур в возрасте 24, 48 и 72 часа.
Тинкториальные свойства изучались путем окрашивания фиксированных над пламенем мазков по Граму, синькой Леффлера и фуксином с последующим микроскопированием. Для изготовления мазков использовались 24-часовые бульонные и агаровые культуры.
Измерение микроорганизмов производилось под микроскопом на окрашенных, фиксированных препаратах с помощью объективного и винтового окулярного микрометра МОВ-1-151 Высчитывалось среднее арифметическое значение от измерения 20 микробных клеток.
Подвижность определялась методом раздавленной капли, а также путем посева уколом в столбик полужидкого мясопептонного агара.
Культуральные свойства изучались по интенсивности и характеру роста на различных жидких и плотных питательных средах. Посев и пересев осуществлялся в стерильных условиях с помощью бактериологической петли диаметром 3 мм, бактериологической иглы или пастеровских пипеток. Все посевы культивировались в термостате при 37±0,5 С. Определение морфологических характеристик производилось через 24, 48, 72 и 120 часов. При отсутствии роста посевы выдерживались в термостате в течение 10 суток. Чашки с агаром Сабуро культивировались при 25 С в течение 15 суток.
При изучении биохимических свойств вначале определялась способность усваивать углеводы. Для этого производился посев на короткий пестрый ряд с индикатором бромтимолблау. Для обнаружения сероводорода использовалась индикаторная бумага, пропитанная уксуснокислым свинцом, для обнаружения индола - индикаторная бумага с реактивом Эрлиха. Способность редуцировать нитраты в нитриты определялась с помощью реактива Грисса. Амилолитическая активность определялась путем посева на агар с крахмалом с последующей обработкой агаровой пластинки раствором Люголя. Протеолитическая активность выяснялась при посеве уколом в столбик мясопептонной желатины, а также при посеве на молочный агар.
Культивирование посевов проводилось при 37±0,5 С (желатина при 25 С). Оценку результатов проводили через 12, 24, 48, 72, 96 и 120 часов от начала культивирования. При отрицательных результатах посевы выдерживались в термостате в течение 10 суток.
Присутствие каталазы определялось путем внесения петли с агаровой культурой в каплю 3 % раствора перекиси водорода. Положительная реакция определялась по появлению пузырьков газа.
: Ацетилметилкарбинол определялся с помощью теста Фогеса-Проскауэра. К 4-5 суточной культуре на среде Кларка добавлялся равный объем 10 % раствора гидроксида калия и выдерживался 24 часа при 37 С. Положительная реакция характеризовалась розово-желтым окрашиванием.
Биологические свойства выделенных культур изучались путем постановки биопробы на белых мышах, морских свинках, и кроликах.
Гемолитические свойства изучались путем посева на мясопептонный агар с добавлением 5 % крови барана.
Изменчивость микроорганизмов изучалась путем длительного хранения культур на скошенном мясопептонном агаре в пробирках при температуре 5-10 С, а также путем многочисленных пересевов через каждые 3-5 дней и последующего повторного изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, биологических свойств, чувствительности к антибиотикам и антагонистической активности.
Идентификация выделенных микроорганизмов производилась после детального изучения их свойств с помощью определителя микробов Д. Бердже (1936), определителя микробов Р.А. Циона (1948), определителя бактерий и актиномицетов Н.А. Красильникова (1958), и краткого определителя бактерий Берги (1980). Для идентификации штаммов микроорганизмов, выделенных от здоровых коров, использовалось также руководство В.В. Смирнова и соавт. (1982), для идентификации штаммов условно-патогенных микроорганизмов применялись "Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями" (№ 044-3 от
Антибиотикочувствительность штаммов условно - патогенных и сим-бионтных микроорганизмов определялась с помощью стандартного набора из 10 бумажных дисков, пропитанных растворами антибиотиков. Все рабо /: / ты проводились согласно действующей инструкции. Мясопептонный агар с концентрацией агара 2 % и рН=7,2 разливался в чашки Петри и затем, после остывания, засевался сплошным газоном испытуемых микроорганизмов. Перед посевом все штаммы освежались путем пересева на скошенный мясопептонный агар. После посева на влажную поверхность агара раскладывались диски с антибиотиком на равном расстоянии друг от друга. В течение трех часов чашки Петри выдерживались при комнатной температуре, а потом помещались в термостат при 37 С на 18-20 часов. Оценка результатов проводилась путем измерения диаметра зоны задержки роста испытуемого микроорганизма с вычитанием диаметра диска (6,5 мм).
Антагонистическая активность изучалась методами бумажных дисков, серийных разведений, смешанных развивающихся популяций и методом лунок с использованием методик Н.С. Егорова (1965).
Метод бумажных дисков, как самый удобный и практичный использовался для определения антагонистического действия 14 культур симбионт-ных микроорганизмов и их сочетаний на 14 культур условно-патогенных микроорганизмов. Из фильтровальной бумаги вырезались диски диаметром 6,5 мм, стерилизовались автоклавированием, затем каждый диск сма-чивался 0,05 см отцентрифугированной культуральной жидкостью антагониста (симбионтного микроба) и высушивался при комнатной температуре. Микробы-антагонисты культивировались на капустном бульоне и молоке при 37 С в течение 96 часов.
Мясопептонный агар в чашках Петри, содержащий 2 % агара (рН= 7,2) засевался сплошным газоном освеженной культурой тест - микроорганизма. Затем, на подсохшую поверхность агара раскладывались диски, смоченные культуральной жидкостью антагониста. После выдержки при комнатной температуре в течение трех часов чашки помещались в термостат на 18-20 часов.
Селективный отбор штаммов симбионтных микроорганизмов с учетом антагонистической активности и разработка из них бактериального препарата
На данном этапе работы вначале изучалась антагонистическая активность полученных нами штаммов Bac.subtilis по отношению к штаммам условно-патогенных микроорганизмов, выделенным от больных эндометритом коров.
Для этого были использованы пять штаммов Bac.subtilis, изученных на первом этапе работы. В качестве тест - микроорганизмов было отобрано 13 наиболее патогенных штаммов E.coli, Staph.albus, Staph.flavus, Salm.typhi murium, а также Staph.aureus (гемолитический, патогенный штамм), полученный из коллекции культур Вологодской областной ветеринарной лаборатории.
Из числа анаэробных микроорганизмов было отобрано пять наиболее патогенных штаммов клостридий (Cl.sporogenes, Cl.perfringens, Cl.oedematiens) и четыре штамма анаэробного пептострептококка (Ps.anaerobius).
Изучение антагонистических свойств проводилось в сравнительном аспекте. Для этого результаты исследования сравнивались с показателями, полученными при испытании антагонистического действия трех эталонных штаммов симбионтных микроорганизмов. В качестве таковых были использованы штаммы L.acidophilus 43с, B.bifidum В1 и препарат "Лакто-бактерин", представляющий собой смесь штаммов L.plantarum и L.buchneri. Выбор штаммов обусловлен тем, что именно эти симбионтные микробы наиболее часто используются для изготовления пробиотических препаратов.
Результаты антагонистического действия микроорганизмов сравнивались также с результатами действия антибиотиков. Для этого использовался стандартный набор из 10 антибиотиков (левомицетин, бензилпе-нициллин, тетрациклин, стрептомицин, полимиксин, неомицин, эритромицин, ампицилин, линкомицин, гентамицин).
Поскольку показатель антагонистического действия микроорганизмов в определенной мере зависит от возраста культуры, то вначале была определена оптимальная продолжительность культивирования. Для этого отобранные пять штаммов Bac.subtilis, три штамма лактобацилл и один штамм бифидобактерий культивировались в жидкой питательной среде (капустный бульон для Bac.subtilis, молоко для лактобацилл и бифидобактерий) в течении трех, четырех и пяти суток. После этого изучалось их антагони стическое действие на четыре штамма условно-патогенных микроорганизмов методом дисков. Учет результатов производился путем измерения диаметра зоны задержки роста тест - микроорганизма с вычитанием диаметра диска (6,5 мм). Для сравнения результатов по каждой группе проводился подсчет средних арифметических значений диаметров зон задержки роста всех четырех тест - микроорганизмов Из таблицы 2.3. видно, что величина зон задержки роста тест - микроорганизмов зависела от длительности культивирования антагонистов и достигала максимума для всех культур кроме L.plantamm и L.buchneri на четвертые сутки.
Для L.plantamm и L.buchneri этот показатель достигал максимума на пятые сутки, и в дальнейшем не увеличивался.
На основании полученных данных было принято решение производить культивирование штаммов антагонистов в течение четырех суток.
Затем был проведен основной опыт по изучению антагонистического действия пяти отобранных штаммов Bac.subtilis, трех штаммов лактоба-цилл и бифидобактерий на 14 штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Использовался также метод дисков, штаммы Bac.subtilis культивировались на капустном бульоне, штаммы лактобацилл и бифидобактерий -на стерильном обезжиренном молоке в течение четырех суток. Учет результатов производился путем измерения диаметра зоны задержки роста тест - микроорганизма линейкой с вычитанием диаметра диска
