Введение к работе
Актуальность проблемы. Сибирская язва продолжает занимать важное место среди болезней, наносящих значительный ущерб животноводству и представляющих угрозу жизни и здоровью человека (Черкасский Б Л., 2002). Несмотря на достигнутые успехи в изучении проблемы сибирской язвы, до сих пор это заболевание имеет довольно широкое распространение во многих странах мира, в том числе и на территории постсоветского пространства (Белова Е В и др., 2004).
На сегодняшний день территория Казахстана остается одной из самых неблагополучных по данной инфекции среди стран СНГ Ежегодно в республике регистрируются как единичные, так и групповые случаи заболевания сибирской язвой среди людей и сельскохозяйственных животных. Такая ситуация обусловлена биологическими особенностями возбудителя, что придает сибирской язве характер почвенно-очаговой инфекции, носящей стационарный характер (Кадастр стационарно-неблагополучных по сибирской язве пунктов РК, 2003)
В последние годы проблема экспресс-индикации возбудителя сибирской язвы приобрела особую актуальность и в связи с зарегистрированными случаями биотерроризма Чрезвычайно высокая поражающая способность и устойчивость к факторам внешней среды делают этот возбудитель одним из наиболее привлекательных для использования его в качестве биологического диверсионного агента (Heselson N et al, 1993).
Сейчас в ветеринарной и медицинской лабораторной практике существует ряд методов для диагностики сибирской язвы и выявления возбудителя в объектах внешней среды и сырье животного происхождения В частности широко применяют методы, определяющие фенотипи-ческие различия штамма, в том числе определение характера роста на различных питательных средах, чувствительность к пенициллину и гамма-фагу, образование капсулы, взаимосвязь со специфическими лекти-нами, проба на ферментацию углеводов, тест на образование сибиреязвенного токсина и ряд других (Агбарян А Г , 2001). Однако эти методы не полностью удовлетворяют ветеринарную и медицинскую практику из-за способности бацилл изменять оцениваемые характеристики, которая выражается в неоднозначности получаемых результатов при установлении видовой принадлежности Кроме того, они требуют много времени и средств
В последнее время существенный прогресс в сфере диагностики инфекционных болезней был достигнут благодаря современным успехам молекулярной биологии, иммунологии, биотехнологии и генетики Наряду с традиционно применяемыми при диагностике сибирской язвы серологическими реакциями, такими как реакция термопреципитации по Аскпли, реакиия диффузной преципитации (РДП), реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), люминесцентно-серологический метод и др.,
предложен целый ряд молекулярно-биологических методов Одним из современных методов диагностики бактериальных инфекций считается полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Ramisse V , 1995; Вишняков И Ф, 1999, Цыбанова ЛЯ, 2002) На сегодняшний день для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы рекомендуются различные модификации ПЦР, такие как использование флуорофорсвязанных праймеров, маркировка мишеневой ДНК дигексигенином, «гнездная» ПНР тест-система Однако ПЦР-анализ требует дорогостоящего оборудования, реактивов и поэтому имеет ограничение в части внедрения в лабораторную практику
В этой связи к наиболее перспективным методам следует отнести иммуноферментный анализ (ИФА), который в последнее время находит все большее применение в разработке методов диагностики особо опасных инфекционных болезней (Булашев А К , 1995; Бакирова Г А, 2001; Сэдэаншиев Ж. А., 2002; Дюсенова Г.Т., 2005) Возможность проведения некоторых вариантов ИФА (точечный вариант) в полевых условиях, вкупе с высокой чувствительностью и экспрессивностью данного анализа открывает широкие перспективы в разработке сигнальных методов диагностики. Как известно, специфичность и чувствительность любой иммунологической реакций зависит от используемых антител или антигенов В этой связи получение против В anthracis однородных по всем свойствам иммуноглобулинов, так называемых моноклональных антител (МКА), имеет большую практическую значимость
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось разработка экспресс-метода обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды на основе использования моноклональных антител к полисахаридному антигену клеточной стенки В anthracis
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи
-
Выделить полисахаридный антиген В anthracis и изучить его им-мунохимические и антигенные свойства
-
Получить штаммы гибридных культивируемых клеток - продуцентов моноклональных антител к полисахаридному антигену В anthracis
-
Изучить основные иммунохимические свойства полученных моноклональных антител
-
Определить условия постановки точечного ИФА для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.
-
Провести лабораторные испытания диагностической тест-системы и разработать научно-техническую документацию на Набор ИФА для индикации возбудителя сибирской язвы
Научная новизна. Установлено, что в клеточной стенке В anthracis имеется полисахаридный антиген, с молекулярной массой 28 кДа, характерны только для сибиреязвенной бациллы
Впервые создан штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus - продуцент моноклональных антител против полисахаридно-
го антигена клеточной стенки В anthracis с авторским названием 3F11, что подтверждено предварительным патентом РК на изобретение (авторское свидетельство № 51722 от 16.04 2007 г, бюль № 4) На основе моноклональных антител (штамм 4D3) к полисахаридному антигену В anthracis отработаны условия приготовления иммуноферментного конъюгата, позволяющего проводить «прямой» и «сэндвич» варианты ИФА для обнаружения сибиреязвенного микроба
На основе моноклональных антител гибридомы 3F11 разработана иммуноферментная тест-система, позволяющая проводить исследования по обнаружению сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды.
Практическая ценность работы. Моноклональные антитела, синтезируемые штаммом гибридных культивируемых клеток с авторским названием 3F11 (депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов, г. Астана), предлагаются к использованию научно-исследовательским учреждениям страны при разработке и совершенствовании методов идентификации возбудителя сибирской язвы
Нормативно-техническая документация на «Набор иммунофер-ментной тест-системы для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды», рекомендуется для скрининга почвы, воды, кормов и др. на наличие в них возбудителя сибирской язвы (согласована с Департаментом ветеринарии МСХ РК 20.12.2005 года и прошла экспертизу в Комитете технической стандартизации и метрологии Министерства индустрии и торговли РК № 002/00800 от 26 декабря 2005).
Основные положения, выносимые на защиту:
Иммунохимические и антигенные свойства полисахаридного антигена клеточной стенки В anthracis;
Свойства моноклональных антител штаммов гибридных клеток, полученных путем слияния миеломной линии Х63 Ag 8 653 с лимфоцитами мышей BALB/c, иммунизированных полисахаридным антигеном В anthracis,
Диагностическая ценность иммуноферментного антисибиреязвенного конъюгата;
- Иммуноферментная экспресс тест-система на основе монокло
нальных антител для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах
внешней среды
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и студентов, посвященной 50-летию Целины (г Астана, 2004), научно-практической конференции молодых ученых Казахской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы медицины» (г Астана, 2005); республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых, аспирантов, магистрантов, студентов и школьников «Сей-Дуллинские чтения-1» посвяшенной 110-летию со дня рождения Сакена Сейфуллина. (г Астана, 2005)
Публикации результатов работы. Материалы диссертационных исследований опубликованы в шести научных трудах Получен предварительный патент РК на изобретение
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Список использованных источников включает 224 наименований, в том числе иностранных 128 Материалы иллюстрированы 15 таблицами, 14 рисунками.
Похожие диссертации на Экспресс-обнаружение возбудителя сибирской язвы в иммуноферментном анализе
