Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Пастереллез птиц 9
1.2. Методы и средства профилактики и терапии пастереллеза птиц 17
1.3. Тиадиазолопиримидины 24
Заключение 29
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
2.1. Структурная формула 8(7-метил-5-оксо-5Н-1,3,4- тиадиазоло [3,2-а] пиримидин-2-ил)-изотиурон гидробромида 30
2.2. Определение антимикробной активности САП-2 31
2.3. Токсикологические исследования САП-2 31
2.4. Методы оценки уровня естественной резистентности 33
2.4.1. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов 33
2.4.2. Определениелитической активностилизоцима в сыворотке крови 34
2.4.3. Определение содержания IgG в сыворотке крови
2.4.4. Определение бактерицидной активности сыворотки
2.4.5. Определение количественного содержания эритроцитов и лейкоцитов 41
2.4.6. Определение гемоглобина 41
2.4.7. Экспресс-метод определения фракций белка сыворотки крови 43
2.5. Бактериологические исследования патологического материала 44
2.6. Производственная проверка лечебно- профилактической эффективности САП-2 44
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47
3.1. Антимикробная активность САП-2 47
3.2. Определение токсико-фармакологических свойств САП-2 49
3.3. Терапевтическая и профилактическая эффективность САП-2 при экспериментальном пастереллезе 53
3.4. Производственные испытания лечебно- профилактической эффективности САП-2 при
пастереллезе 57
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 64
ВЫВОДЫ 71
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 73
Список работ, опубликованных по теме диссертации 74
ЛИТЕРАТУРА 76
ПРИЛОЖЕНИЕ 101
- Пастереллез птиц
- Токсикологические исследования САП-2
- Определение токсико-фармакологических свойств САП-2
Введение к работе
Актуальность темы. Пастереллез птиц представляет серьезную угрозу эпизоотическому благополучию птицеводства Республики Таджикистан и наносит отрасли значительный экономический ущерб. Заболевание приобрело широкое распространение в Таджикистане, и его удельный вес в числе других инфекционных болезней значительно возрос. Трудность профилактики пастереллеза обусловливается тем, что эффективность существующих вакцин в каждом конкретном случае зависит от соответствия по соматическому О-антигену вакцинных и эпизоотических штаммов пастерелл [32].
В комплексе ветеринарно-санитарных мероприятий при бактериальной патологии важным элементом является использование химиотерапевтических средств, среди которых широкое применение нашли антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны и другие химиотерапевтические препараты. Однако в связи с развитием резистентности микроорганизмов к используемым лекарствам остро стоит проблема разработки эффективных синтезированных средств лечения и профилактики бактериальных инфекций птиц [4, 58, 74, 109].
В течение последнего десятилетия значительно расширились исследования в области химии и биологической активности конденсированных производных 1,3,4-тиадиазола, среди которых особое место занимают 1,3,4-тиадиазоло[3,2-а]пиримидины.
Таджикским научно-исследовательским ветеринарным институтом Таджикской академии сельскохозяйственных наук разработан и
изготовлен препарат САП-2 (синтетический аналог пурина) — смесь (1:1) 8(7-метил-5-оксо-5Н-1,3,4-тиадиазоло[3,2-а]пиримидин-2-ил)-изотиурон гидробромида с сахарозой, имеющий широкий спектр антибактериального действия и проявляющий высокую активность в отношении этиологически значимых в промышленном птицеводстве бактерий.
Цель исследований - изыскать и предложить для внедрения в ветеринарную практику новое химиотерапевтическое средство для лечения и профилактики бактериальных болезней птиц, обладающее высокой бактерицидностью и не оказывающее отрицательное влияние на резистентность организма.
Для достижения этой цели решены следующие задачи:
изучить антимикробную активность САП-2 в отношении возбудителей наиболее распространенных бактериальных заболеваний птиц;
исследовать в опытах на лабораторных животных и цыплятах острую и хроническую токсичность препарата;
изучить в опытах на цыплятах лечебную и профилактическую эффективность САП-2, определить оптимальные дозы, разработать схемы применения препарата;
провести производственные испытания терапевтической и профилактической эффективности САП-2 при пастереллезе птиц.
Научная новизна. Разработан новый препарат САП-2, выявлена
его антимикробная активность, исследованы токсико-
фармакологические свойства, влияние на защитные механизмы
организма птиц, определена лечебная и профилактическая эффективность препарата при пастереллезе птиц.
Практическая ценность. Высокая бактерицидная активность САП-2, низкая токсичность и незначительное влияние препарата на защитные механизмы организма позволяют рекомендовать препарат САП-2 для внедрения в ветеринарную практику в качестве терапевтического и профилактического средства при бактериальных болезнях птиц.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Результаты изучения антимикробной активности САП-2 в отношении Staphilococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pasteurella multocida, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae.
Результаты исследования острой и хронической токсичности препарата.
3. Результаты экспериментального изучения лечебной и
профилактической эффективности САП-2.
4. Результаты производственных испытаний терапевтической и
профилактической эффективности препарата при пастереллезе птиц.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета Таджикского аграрного университета (2001 - 2003); республиканских и областных семинарах-совещаниях ветеринарных работников РТ (2001 - 2003); Международной конференции ВНИВИ патологии, фармакологии и
терапии РАСХН «Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях» (Воронеж, 2002); Международной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве» (Санкт-Петербург - Ломоносов, 2004).
Публикации. По результатам исследований опубликованы 4 научные работы. Получено уведомление Национального патентно-информационного центра РТ №02000745 (от 13.05.2002 г.) о положительном результате формальной экспертизы по заявке на изобретение «8(7-метил-5-оксо-5Н-1,3,4-тиадиазоло[3,2-а]пиримидин-2-ил)-изотиурон гидробромид, проявляющий антибактериальную активность».
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.
Диссертация изложена на 111 страницах, иллюстрирована 11 таблицами и 10 рисунками. Список литературы содержит 208 источников. В приложение включены материалы, подтверждающие внедрение результатов исследования в практику.
Пастереллез птиц
Пастереллез (холера птиц, птичья холера, птичий пастереллез, птичий геморрагический сепсис) - инфекционная болезнь, поражающая домашних и диких птиц [147, 146, 199]. Обычно проявляется в септической форме, характеризующейся высокой заболеваемостью и смертностью [34], но довольно часто может протекать хронически или в легкой форме [86].
Возбудителем пастереллеза является Pasteurella multocida -грамотрицательная неподвижная неспорогенная палочка (0,2 — 0,4 х 0,6 - 2,5 мкм, но может принимать другую форму после повторного пересева), причем палочки встречаются как по отдельности, так и в парах, а иногда в виде цепочек или нити [165]. У недавно выделенных культур согласно косвенным методам окрашивания наблюдается капсула. В тканях, крови и недавно выделенных культурах микроорганизм окрашивается биполярно. Возможно наличие фибрилл [15, 127, 128, 195]. По иммунологической классификации Робертса или Картера пастереллы делятся на четыре типа - А, В, С, D. Большинство штаммов, выделенных от птиц, относится к типу А [21, 22, 62, 115, 118].
Инфекцию распространяют больные и переболевшие домашние и дикие птицы [11], животные [154, 168, 205], грызуны, насекомые [183], она передается через яйца, полученные от больных птиц [27]. Большую опасность представляет заражение кур при расклевывании инфицированных трупов птиц [41, 69].
Чаще всего невозможно определить, каким образом возбудитель пастереллеза попадает в скопление птиц. Главными источниками распространения инфекции считаются хронически инфицированные птицы, продолжительность жизни которых является единственным пределом хронического носительства [5, 51, 55, 105].
Сезонностью, стационарностью, пастереллоносительством и хронической формой проявления этой болезни или диагностированием смешанной инфекции чаще всего определяются особенности течения пастереллеза [24, 40, 73, 152, 169].
Наибольшее распространение пастереллез получает в весенний, осенне-зимний периоды. Основной причиной возникновения заболевания скорее могут считаться погодные условия, чем пониженная сопротивляемость, за исключением того, что с достижением зрелости птицы становятся более восприимчивыми. Неблагоприятные условия содержания (низкая температура, высокая влажность, сырость и уменьшенная солнечная радиация, изменения в питании, повреждения и волнения) снижают естественную устойчивость организма и предполагают к заболеванию пастереллезом [7, 60, 121, 129, 137, 141].
Не исключая влияния неблагоприятных факторов на появление, распространение и течение пастереллеза, некоторые исследователи [87, 124] отрицательно относятся к теории о широком пастереллоносительстве птиц и считают, что болезнь возникает в хозяйстве только при заносе вирулентного возбудителя извне.
В скоплениях птиц распространение P. multocida происходит прежде всего за счет выделений изо рта, носа и конъюнктивы больных птиц, которые контаминируют среду обитания, особенно корм и воду. В фекалиях очень редко содержится жизнеспособная P. multocida [194, 197].
Наиболее восприимчивы к пастереллезу, поражающему все виды домашней птицы всех возрастных групп, цыплята 2 — 3-месячного возраста и старше, смертность среди которых достигала 80% [50, 120], а среди взрослых птиц - 95 - 100% [48], большей устойчивостью обладают цыплята до 2-месячного возраста [49, 129, 131, 143, 192, 193, 203, 208].
У молодых цыплят пастереллез обычно вызывается серотипом А и часто протекает в осложненной некоторыми другими болезнями форме [38].
Чрезвычайно восприимчивы к заболеванию пастереллезом одомашненные гуси и утки [138, 144, 147].
В литературе описаны несколько форм пастереллеза: молниеносная, острая, подострая и хроническая [57, 114].
При молниеносном течении куры погибают, не проявляя клинических признаков заболевания. Изменения в трупах птиц отсутствуют [8, 89, 101].
Токсикологические исследования САП-2
При определении опсоно-фагоцитарной реакции использовали свежевзятую кровь. Кровь брали из крыловой вены стерильной иглой, промытой 2%-ным раствором лимоннокислого натрия, в стерильные пробирки с тем же раствором в соотношении 1:1. Далее к 0,5 мл цитратной крови добавляли 0,25 мл суточной микробной взвеси (золотистый стафилококк штамм 3), выдерживая соотношение 2%-ного раствора цитрата, крови и микробной взвеси, как 1:1:1.
Густоту микробной взвеси доводили до 2 млрд микробных клеток в 1 мл физиологического раствора под контролем оптического стандарта мутности Государственного контрольного института им. Л. А. Тарасевича. Микробную взвесь инактивировали при 70С в течение 30 мин.
Затем пробирки с приготовленной смесью осторожно встряхивали и ставили на 30 мин в термостат при температуре 37 - 38С. Через каждые 10 мин пробирки встряхивали, из крови готовили тонкие мазки, фиксировали их метиловым спиртом (3-5 мин) и окрашивали по методу Паппенгейма. При микроскопии мазка из общего количества подсчитывали число фагоцитировавших лейкоцитов. Подсчет фагоцитированных микробов вели в 100 лейкоцитах.
Фагоцитарная активность выражается процентным отношением активных, участвовавших в фагоцитозе псевдоэозинофилов, к общему числу подсчитанных [81].
Из гуморальных факторов естественной резистентности одно из первых мест принадлежит лизоциму, который в сыворотке крови играет двоякую роль. Во-первых, оказывает антимикробное действие на широкий круг микробов-сапрофитов, разрушая в клеточных стенках мукопротеидные вещества. Во-вторых, не исключено его участие в реакциях приобретенного иммунитета.
Турбодиметрический метод определения литической активности лизоцима в сыворотке крови Д. Г. Дорофейчук (1968) в модификации сотрудников кафедры птицеводства и болезней птиц МВА основан на высокой чувствительности Micrococcus lysodeicticus к воздействию лизоцима. В присутствии культуры Micrococcus lysodeicticus происходит ее разрушение и просветление исходной микробной взвеси, что фиксируется показаниями на электрофотоколориметре.
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки, рН-метр, термостат, водяная баня, ФЭК, весы.
Для суспензирования микробной взвеси готовили фосфатный буфер (рН 7,2) следующим образом: 28 мл 1/15 М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (0,9078 г КН2РО4 растворяли в 100 мл дистиллированной воды) смешивали с 72 мл 1/15 М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия (0,9476 г Na2HP04 растворяли в 100 мл дистиллированной воды).
Ход определения. В каждую пробирку микропипеткой вносили по 0,1 мл сыворотки крови. После этого штатив с пробами ставили на 30 мин в водяную баню при температуре 56С. При этом разрушаются комплемент, пропердин и другие термолабильные начала, способные и в отсутствии лизоцима вызвать лизис микробных культур. В это время готовили (4 млрд) стандартную культуру в 1 мл буфера. Взвесь стандартизовали на ФЭКе против раствора фосфатного буфера, используя зеленый светофильтр (длина волны - 540 ммк) в кюветах с рабочей длиной 3 мм.
После выдерживания в бане пробам дали остыть до комнатной температуры и внесли в каждую пробирку строго по секундомеру с интервалом 1 мин по 1,4 мл стандартной культуры, встряхнули и поставили в водяную баню на 45 мин при температуре +39С. По истечении времени в той же последовательности пробирки вновь встряхнули и фотометрировали при тех же условиях, соблюденных при стандартизации исходной культуры.
Определение токсико-фармакологических свойств САП-2
При изучении токсичности САП-2 на лабораторных животных и цыплятах определены (табл. 3) максимально переносимая доза — соответственно 252 и 254 мг/кг, ЛДюо - 1230 и 1250 и ЛД50 - 530 и 590 мг/кг массы тела. САП-2 относится к среднетоксичным препаратам.
При остром отравлении белых мышей и цыплят наблюдали непродолжительный период возбуждения с усилением двигательной активности у большинства особей. Затем развивались резко выраженное угнетение и жажда. Подопытные животные и цыплята не принимали корм. К моменту гибели у них отмечали учащение сердцебиения и дыхания, последнее часто становилось поверхностным и прерывистым. Развивалась синюшность кожи и слизистых оболочек. Смерть наступала на 1 - 3 сутки в состоянии глубокого угнетения.
Патологоанатомические изменения острого отравления лабораторных животных характеризовались гемодинамическими расстройствами. Печень и почки полнокровны, незначительно увеличены, окраска неравномерная с фиолетовым оттенком. У большинства павших животных легкие гиперемированы, в них присутствовала отечная жидкость; сердце растянуто, предсердия заполнены темно-вишневой кровью; под эпикардом, особенно в области ушек, наблюдали множественные кровоизлияния.
Желудок у цыплят при вскрытии пуст, слизистые оболочки желудка и тонкого отдела кишечника гиперемированы, покрыты мелкоточечными кровоизлияниями. В просвете тонкого отдела кишечника у отдельных цыплят отмечено скопление значительного количества слизи.
Исследование хронической токсичности САП-2 показало, что поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова подопытных и контрольных белых мышей не отличались.
При введении САП-2 цыплятам не отмечали существенных изменений в состоянии птицы. Цыплята активно двигались и хорошо поедали корм.
Установлено, что САП-2 не влияет на уровень естественной резистентности цыплят (фагоцитарная активность лейкоцитов -57,0±2,76%; литическая активность лизоцима - 32,90±1,53% лизиса; содержание иммуноглобулина G - 7,6+0,34 мг/мл; бактерицидная активность сыворотки крови - 74,62+3,57%) (табл. 4), гематологические (количество в крови эритроцитов - 3,1 ±0,13 млн/мм , лейкоцитов -25,2±1,20 тыс/мм3, гемоглобина - 10,4±0,48 г%) (табл. 5) и биохимические (общий белок в сыворотке - 3,45±0,12 г%; белковые фракции: альбумины - 40,5+1,91%, сс-глобулины - 18,9±0,87%, р 51
глобулины - 21,2+1,01%, у-глобулины - 19,6±0,87%) (табл. 6) показатели крови, которые находились в пределах физиологической нормы.
