Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Морфология Bacillus anthracis 11
^ 1.2 Секретируемые факторы вирулентности Вас.anthracis 13
1.3 Сибирская язва и её диагностика 15
Иммунитет и иммунизация 18
Производство моноклональных антител и их практическое применение. 25
«у 1.5.1. Применение моноклональных антител 26
1.5.2. Диагностика бактериальных инфекций 27
Перспективы терапевтического применения 30
Принципы получения моноклональных антител 31
1.6. Применение МкАт для изучения сибирской язвы и её обнаружение в
объектах исследования 35
/^ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
Лабораторные животные 37
Антигены 37
Штаммы 38
| 2.4. Сыворотки, антитела 38
Антисыворотки 38
Иммунизация 38
Приготовление ультразвуковых дезинтегратов микробных клеток 39
Синтез конъюгатов антител с пероксидазой хрена 39
Миеломные клетки 40
\ 2.10. Культуральные среды 40
Посуда 41
Подготовка миеломных клеток к слиянию 41
Приготовление слоя фидерных (подкормочных) клеток 41
Получение иммунных спленоцитов 42
Раствор полиэтиленгликоля 42
Гибридизация клеток 42
Отбор гибридных культур-продуцентов специфических антител (первичное тестирование) 43
Клонирование гибридных клеток 43
Заморозка и разморозка гибридных и миеломных клеток 44
2.20.Культивирование гибридных клеток in vivo 44
Очистка моноклональных антител 45
Использование штаммов гибридных культивируемых клеток для получения моноклональных антител 45
Исследование специфичности иммунохимических свойств МкАт 46
Твердофазный иммуноферментный анализ 46
Иммуноблоттинг 47
Определение изотипаМкАт 47
2. 24. Определение концентрации белка 47
2. 25. Статистическая обработка результатов 48
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ
Вас. anthracis, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА 49
Иммунизация 49
Подбор условий постановки твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА) 51
Гибридизация 52
Подготовка клеток к слиянию, гибридизация 52
Получение первичных культур гибридных клеток 52
Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 - ВНИИВВиМ 53
Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных дезинтегратом вегетативных клеток (суточной культурой) вакцинного сибиреязвенного штамма 55 -ВНИИВВиМ 55
3.3.5. Получение гибридом при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных очищенным протективным антигеном Вас. anthracis
3.4. Изучение свойств моноклональных антител 58
3.4.1. Изучение видовой специфичности моноклональных антител 58
3.4.2. Культивирование гибридом-продуцентов, продуцирующих
антитела in vivo 59
3.4.3. Определение изотипа моноклональных антител 61
3.4.4. Иммунохимический анализ 61
ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МКАТ ДЛЯ
ф КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПА Вас. anthracis 64
Приготовление конъюгатов на основе моноклональных антител 64
Подбор пары МкАт для сэндвич-ИФА 65
Сравнение различных вариантов ИФА для количественного определения ПА с использованием полученных МкАт 69
ГЛАВА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И
/ф ПЕРСПЕКТИВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 73
Использование МкАт для идентификации Вас. anthracis 73
Оценка возможной пригодности полученных МкАт для характеристики живых споровых вакцинных штаммов и для стандартизации бесклеточных
(ф вакцинных препаратов 74
5.3. Перспективы использования МкАт для определения уровня
защищенности животных от заражения сибирской язвой, привитых
различными вакцинными штаммами 75
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ґф ВЫВОДЫ 87
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 87
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88
Список принятых сокращений
СНО - (Chinese hamster ovary cells) клетки яичника китайского хомячка
LD - летальная доза
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
Vir - вирулентность
Аг - антиген
Ат - антитело
Агг - агглютиноген
АДФ - аденозиндифосфат
АК- антикроличий
AM - антимышиный
АМФ - аденозинмонофосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГОА - гидроокись алюминия
ГТ - гипоксантин - тимидин
ГАТ - гипоксантин - аминоптерин - тимидин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДСН - додецилсульфат натрия
ИФА - иммуноферментный анализ
КРС - крупный рогатый скот
КББ - карбонат-бикарбонатный буфер
ЛОС - липоолигосахарид
ЛПС - липополисахарид
ЛФ - летальный фактор
МкАт - моноклональные антитела
НАД - никотинамидаденин динуклеотид
НЦ - нитроцеллюлоза
ОФ - отёчный фактор
ПА - протективный антиген
ПААГ - полиакриламидный гель
ПХ - пероксидаза из корня хрена
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
СПК - сыворотка плодов коровы
ТМБ - тетраметилбензидин
ТЛТ - термолабильный токсин
ТСБ - трис-солевой буфер
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФГА - филаментозный гемагглютинин
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ФСБТ - фосфатно-солевой буфер + твин 20
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Введение к работе
Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов), диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб [3, 7, 8]. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределённо долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотии и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использовании животноводческой продукции, полученной от больных животных (мясо, шкуры, шерсть и др.). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около 20 тыс. человек, нередко отмечается и летальный исход [1-6].
В России в настоящее время зарегистрировано около 72 тыс., потенциальных очагов сибирской язвы [7]. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остаётся неучтённым, и по данным ряда исследователей именно они являются источником поступления возбудителя сибирской язвы в природную среду [7]. В итоге, государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор Минздрава РФ) оценивает эпидемическую обстановку в отдельных регионах страны как напряженную [3,7].
Перспективы совершенствования методов борьбы с сибирской язвы, как в медицинской, так и в ветеринарной практике напрямую связаны с созданием и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителя, а также с совершенствованием существующих средств профилактики.
Традиционные методы бактериологической индикации и идентификации возбудителя включающие: приготовление и окраску мазков, посев на питательные среды, биопробу, а также проведения ряда дополнительных исследований (тест «жемчужного ожерелья», лизабельность фагом, иммунофлюоресцентный тест), обеспечивают получение окончательного результата в сроки не ранее 2-3 суток от момента начала исследования, что существенно тормозит и соответственно усложняет проведение адекватных мер по локализации очага инфекции.
Иммунохимические методы, которые успешно применяются для индикации патогенных микроорганизмов и соответствующих антител уже более 50 лет, позволят во многом решить эту проблему [8, 51]. Примером могут служить созданные за последние годы лабораторные тест-системы для диагностики таких болезней как бруцеллез, туберкулёз, бешенство, иерсиниоз и др. [76, 109].
В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения (гаптены), белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты: бактерии, риккетсии, вирусы и тд. Главная задача при разработке иммунодиагностической тест-системы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопического сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности иммуноанализа, достигаемое за счёт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену и разработке молекулярных систем усиления результата специфического взаимодействия антигена с антителом. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МкАт) с заданными свойствами. Их использование в
диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. [35, 108].
Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.
Цель работы
*
Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Вас.anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагностикумов.
Задачи исследования
При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных
бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и
тестирования гибридом.
2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus
4« anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.
Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.
Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.
4 5. Разработать методы использования моноклональных антител для
качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.
Научная новизна
Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Bacillus anthracis.
Представлены доказательства преимущества применения тестов на
(# основе моноклональных антител по сравнению с классическими методами
диагностики и идентификации возбудителя.
Положения, выносимые на защиту
Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.
На основе полученных моноклональных антител разработаны
специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и
количественного определения протективного антигена сибиреязвенного
токсина в биологическом материале и метод выявления антител к
протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных.
(# Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, доложены:
на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием
имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге
2004» 23-25 мая 2004 г.
На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005
года.
На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3
июня 2005 года.
ж По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической
печати 3 научные статьи.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований,
обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 10 таблицами.
