Введение к работе
1. 1.1. Актуальность проблемы
В комплексе мероприятий по оздоровлению неблагополучных хозяйств от хронических инфекций ( туберкулез, бруцеллез, лейкоз крупного рогатого скота и др.), важное место занимает совершенствование методов диагностики, изыскание новых приемов лечения, специфической профилактики и способов контроля эффективности санитарных мероприятий с учетом экологии внешней среды.
В этой связи весьма перспективными являются разработка и внедрение в ветеринар-нут практику современных методов, способов и методик лабораторного исследования, которые в настоящее время традиционно основываются на проведении целого ряда исследований, включающих изучение культурально-морфологических, биохимических, тинкториальных, антигенных и других биологических свойств возбудителен различных инфекций, что весьма громоздко,требует значительных затрат времени, материалов и труда , а в отдельных случаях при глубокой изменивости микроба ( на примере L-транс-формацни бруцелл ) они не обеспечивают надежной их индикации и идентификации.
Существенную роль в решении данной проблемы могут играть новейшие физико-химические методы биодетекции разных форм микроорганизмов, которые бы совмещали простоту исполнения методики и возможность автоматизации процесса исследований с повышением чувствительности и специфичности способов идентификации.
В последние десять лет в биохимии и молекулярной биологии появилось несколько новых ускоренных и чувствительных методов химического анализа, которые легко выполнимы за счет использования новых приборов и компьютерной обработки результатов (Pay B.W.,Kilburn J.O., Ш7, Винаров АЛО. и др., 1987, БенсассонР., ЛэндЭ., 1987). Соединение достижений в применении технических средств с прогрессом в изучении химической систематики микроорганизмов, особенно бактерий, способствует развитию экспресс-методов детекции и идентификации, основанных на молекулярных свойствах (Nelson W.H., 1985; Вилков Л.В., Пентин Ю.А.» 1987). Особое место среди них отводится колебательной спектроскопии, и в частности, высокоспецифнческнм методам спектроскопии комбинационного рассеяния света ( Кэри П., 1985).
Появление нового поколения КР-спектрометров, высокочувствительных систем детекции и надежных лазерных источников, позволяющих возбуждать спектры КР в диапазоне от вакуумного ультрафиолета до инфракрасной области, резко повысило возможности метода, и предопределило его применение для решения широкого круга задач в молекулярной биологии, биотехнологии и генной инженерии (Kelly P.B.et al.,1987).
Существенно расширил возможности метода СКР разработанный в последствии метод спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния света (РКР). Резонанс в дани случае означает близость или совпадение частоты возбуждающего света с частотой одні го нз электронных переходов молекулы. Наблюдаемый эффект РКР не имеет аналога в других методах оптической спектроскопии. В этих условиях значительно увеличнваютс интенсивности отдельных линий в спектре КР, так что их абсолютная интенсивность может возрастать на 3...5 порядков.
В настоящее время развивается метод РКР с возбуждением в ультрафиолетовой области (УФ РКР). Он нашел широкое применение за рубежом в исследовании структуры свойств биологических молекул - ароматических аминокислот, белков, нуклеиновых кн лот и отдельных клеток (lohnson C.R. et al.,1984; ZigelenL.D. et al.,1984; BritonK.A.,1988
Одно из главных преимуществ рассматриваемого метода заключается в возможное наблюдать спектры в водных растворах - естественной среде обитания микроорганизме исследовать живую клетку и получать информацию о хемотаксономнческих маркерах і
ее дополнительной дезинтеграции и использования при анализах дорогостоящих реакти вов. К началу настоящей работы информация по изучению возбудителей хронических инфекций, методические подходы по их идентификации методом УФ РКР и отечественные экспериментальные установки отсутствовали.
Не менее актуальным остается изыскание новых препаратов для борьбы с туберкул зом, бруцеллезом и другими заболеваниями в животноводстве ( Клебанов М. А., Ротов. А.Т., Богаевский А.Т. и др. 1965, Хайкин Б.Я., Власова Е.Е., 1985, Красиков А.П., 1996 Начальным этапом оценки нового препарата являются исследования in vitro, в процессе которых определяют его эффективность по наличию или отсутствию роста определенно вида возбудителя заболевания на питательных средах с добавлением исследуемого преп рата н острой токсичности в эксперименте на белых мышах. Однако получаемая ннфор мация не позволяет оценить степень функциональных изменений, например микобакте-рий после воздействия определенного препарата. Судить же о таком свойстве, как изменение вирулентности можно только по результатам биопробы.Но и эти данные недостаточно полно раскрывают механизм действия предлагаемого препарата и степень изменч вости бактерий в зависимости от его дозы. Таким образом, необходим метод, использов ние которого позволит с достоверностью оценить эффективность изучаемых препаратої на основании знания механизма действия, включая структурно-функцинальные измене-ния, возникающие в клетке под их действием.
В системе ветерннарно-санитарных мероприятий, проблема обеззараживания и
утилизации навоза является одной нз важнейших с учетом охраны окружающей среды. Хотя к настоящему времени предложены и используются различные способы обработки и контроля эффективности обеззараживания навоза и жидких стоков животноводческих ферм и комплексов, эта проблема является далеко неразрешенной ( Поляков А.А.,1969, Романенко Н.А., 1977, Симонов А.П., 1978, Майоров А.П. и др., 1979, Черепанов А.А., 1985, Колычев Н.М., 1992).
Кроме того, при оздоровлении хозяйств от хронических инфекций в системе организационно-хозяйственных мероприятий предусматривается создание изолированных ферм по выращиванию телок и формирование здоровых дойных гуртов, которые по ряд)' причин круглый год находятся без выпасов и прогулок, что приводит к различным заболеваниям, особенно в послеродовой период (Нежданов А.Г.,1990, Шипилов B.C., 1991, Иноземцев В.П., 1992, Никоноров П.Н. и др., 1992, Юшков Ю.Г., 1995 ).
В настоящее время для лечения и профилактики болезнен у коров разработано много средств, методов и схем, включающих: этиотропную и новокаиновую терапию, гормональные н витаминные препараты, дезинфицирующие растворы, грязи, аутогемо- и тка-нетерапню, в том числе и физиотерапию. Одним из ее направлений является - злектро-нейроетимуляция, которая широко применяется в медицине за счет разработанных там способов лечения и профилактики различных заболеваний,т.к. она рефлекторно действует на весь организм н его системы, а также локально на отдельные органы, повышает защитные и адаптационные способности организма, улучшает кровоснабжение, оказывает противовоспалительное, болеутоляющее, спазмолитическое и нейротропное действие В ветеринарии, к началу наших изысканий в этом направлении, проводились только поисковые работы.
1.2. Цель и задачи исследований Цель исследований - разработать методические подходы к использованию ультрафиолетовой резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния ( УФ РКР ) для биодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций, разработка новых физико-химических методов и способов определения противотуберкулезной активности хи-миопрепаратов, контроля эффективности обеззараживания навозных стоков, электроней-ростимуляции животных.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: - разработка методики исследования живых культур микобактернй н бруцелл УФ РКР с использованием экспериментальной установки на основе отечественного приборостроения, получение воспроизводимых спектров разных видов возбудителей туберкулеза и бруцеллеза животных;
провести селективное исследование основных хемотаксономнческнх маркеров мик бактерий и бруцелл (белкового ц нуклеоидного компонентов) in vitro;
выявить характерные линии спектров и вкдоспецифнческне области для создания банка данных с последующей идентификацией микобактерий и бруцелл на разных ста днях изменчивости ( R-, L'), сравнить УФ РКР с другими методами исследования;
разработать метод определения ітротквотуи*рк>ііе5ной активности химиопрепара-тов in vitro с помощью элекрошюй микроскопии;
разработать способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков
разработать способ электронейростнмуляцни для сельскохозяйственных жнвотны
1.3. Научная новизна
Представлен для изучения и идентификации возбудителей хронических инфекций метод нового поколения - лазерная спектроскопия ультрафиолетового резонансного комбинационного рассеяния ( УФ РКР ).
На базе созданной в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИ-ИБТЖ экспериментальной установки УФ РКР - отработаны методические подходы при менения спектроскопии УФ РКР для изучения биообъектов, разработана методика иссле дования микобактерий и разных форм бруцелл in vitro.
Впервые получены спектры УФ РКР разных видов .микобактерий и бруцелл, установлены высокоспецнфическне области спектров для идентификации культур.
Установлена закономерность изменений спектральных характеристик нуклеотидно го компонента в зависимости от возраста микобактерий и стадии R-, L- трансформации бруцелл.
Впервые проведено исследование структурных перестроек белкового и нуклеотидно-го компонентов клеток микобактерий с помощью УФ РКР и изучена молекулярная структура белков после Y-облучения.
Разработан метод оценки противотуберкулезной активности химиопрепаратов in vitro с помощью электронной мнкроскопиа
На уровне изобретений разработаны два способа и устройство для контроля эффективности обеззараживания навозных стоков.
Получен патент РФ на способ электронейростнмуляцни животных. 1.4. Теоретическая и практическая значимость Теоретическая ценность работы заключается в том, что установлена уникальная воз-"ШЖНоспГУФ .РКР для изучения электронно-конформацнонных характеристик биомолекул в составе живой клетки, что позволяет исследовать любые микрроргаизмы в различ-
ных физиологических состояниях, оценивать воздействие лекарственных н дезинфекционных средств, направленно отбирать штаммы или их фрагменты для создания новых днагностикумов и вакцин.
Практическая значимость работы состоит в том, что предложенные методические подходы использования спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций находят применение при разработке нового экспресс-метода диагностики инфекционных заболеваний животных, который позволяет качественно, С высокой достоверностью за счет автоматизации Процесса исследований с помощью ЭВМ определять видовую и внутривидовую принадлежность возбудителей инфекций в ветеринарной практике и медицине.
Кроме того, разработанная методика открывает возможности использования УФ РКР для идентификации и изучения любых бактериальных культур, независимо от их морфологических и функциональных особенностей, в том числе стадий изменчивости (R, L-форм бруцелл).
Предлагаемый метод определения противотуберкулезной активности химиопрепаратов с помощью электронной микроскопии позволяет уже на начальных этапах испытаний новых туберкулостатиков по ультраструктурным изменениям клеток мнкобактерий и результатам оценки токсичности проводить отбор наиболее перспектвных препаратов.
Разработанные способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков используются на крупных комплексах и фермах промышленного типа.
Внедрение в ветеринарную практику страны нового направления в физиотерапии -электронейростимуляции животных, позволяет нрофнл актировать и сокращать различные заболевания в послеродовой период, уменьшать наполовину расходы на применяемые медикаментозные препараты. Способ доступен специалистам всех уровнен, может быть использован в условиях крупных ферм и мелких фермерских хозяйств.
1.5. Апробация работы Материалы диссертационной работы доложены н обсуждены: на заседаниях Ученого совета Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных ( Омск, 1980-1997 ), на рабочей комиссии ОНКвет ВАСХНИЛ "Профилактика бруцеллеза и туберкулеза животных" ( Москва, 1989 ), Всесоюзных и Всероссийских координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных (Омск, 1980-1996, Кустанай, 1986, Новочеркасск, 1989, Новосибирск, 1985,1988,1992 ), Всесоюзной научно-теоретической конференции по биотехнологии в животноводстве ( Новосибирск, 1991 ), 1-ом Междуна-
родном конгрессе по биофизики и биотехнологии ( Турция, 1991 ), на Практическом семинаре в Институте спектроскопии Гумбольского университета ( Германия, 1991), научной конференции, посвященной 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики туберкулеза н паратуберкулеэа ВИЭВ ( Москва, 1992), научной конференции преподавателей Омского ветеринарного института ( Омск, 1992 ), иа заседании секции "Инфекционная патология животных" отделения ветеринарии РАСХН (Москва, 1993), научно-практической конференция по проблеме туберкулеза и бруцеллеза ( Новосибирск, 1995 ).
1.6. Публикация результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 43 работы в сборниках научных трудов СибННВИ, ВНЇІИВТЖ, ВИЭВ, ШВС и ДВ СО РАСХН, в журналах "Ветеринария", "Сибирский вестник с.-х. науки", "Прикладная спектроскопия", материалах Всесоюзных и Республиканских научных конференций и других научных и научно-производственных изданиях, описаниях к Авторским свидетельствам СССР .
1,7, Объем и структура диссертации
Диссертация наложена 305 страницах, иллюстрирована 19 таблицами, 60 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной и методической части, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений н приложения. Список литературы включает 612 источников, в том числе 340 отечественных И 272 иностранных.
1.8. Внедрение результатов исследований Научные данные, касающиеся новых методических подходов к использованию спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций, используются в учебном процессе на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ и на кафедре эпизоотологии Института ветеринарной медицины Омского государственного аграуниверентета
Методические рекомендации по оценке противотуберкулезной активности препаратов, рассмотрены и одобрены экспертной комиссией Отраслевого научного комплекса по ветеринарии ВАСХНИЛ н рекомендованы для научно-исследовательских учреждений, занимающихся вопросами испытания химиопрепаратов при туберкулезе.
Разработанные способы для контроля эффективности обеззараживания навозных стоков, учтены при разраооткеТгунктов 2.2 и Д.6"*Иястрткция-по-пабораторному. г.оц. тролю очистных сооружений на животноводческих комплексах"( утв. МСХ СССР,198(Г
Рекомендации по применению электроненростнмулятораЭТНС-100-Ш (утв. ГУВ МСХ СССР, 1991 ) и в настоящее время идет внедрение этого способа профилактики и лечения животных через областные и районные вет.станцнн по борьбе с.-х. животных в зоне Урала, Сибири, Алтайского края н Дальнего Востока.
1.9. Основные положения, выносимые на защиту
Методические подходы использования спектроскопии УФ РКР для бнодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций на примере туберкулеза и бруцеллеза животных и возможность селективного исследования структурно-функциональных особенностей биологических компонентов в составе целой клетки.
Методика исследования и результаты изучения микобактерий, S-, R- и L-форм бру-целл разных видов с помощью спектроскопии УФ РКР.
Метод оценки противотуберкулезной активности хнмиопрепаратов ia vitro на основе электронной микроскопии.
Способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков.
Способ электронейростимуляции па животных.
