Содержание к диссертации
Введение
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. Этиология и патогенез сальмонеллезов 8
2.2. Эпизоотологические и клинические данные при сальмонеллезе 16
2.3. Меры профилактики сальмонеллезов животных 20
III СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 32
3.1. Материалы и методы исследования 32
3.2. Результаты собственных исследований 37
3.2.1. Определение антагонистической активности споробактерина in vitro методом совместного культивирования 37
3.2.2. Определение антагонистической активности споробактерина in vitro методом штриховых посевов 39
3.2.3. Определение антагонистической активности споробактерина in vivo 41
3.3. Изучение иммуноомодулирующей роли споробактерина при вакцинации кроликов 46
3.3.1. Динамика противосальмонеллезных антител у кроликов в ответ на введение вакцины 47
3.4. Применение споробактерина в системе специфической вакцино-профилактики сальмонеллеза телят 51
3.4.1. Результаты исследований в ООО «Димитрово» Тюльганского района 51
3.4.2. Результаты исследований в колхозе им. Чкалова Тюльганского района 65
3.4.3. Результаты исследований в ЗАО «Нива» Октябрьского района 74
3.5. Экономическая эффективность применения споробактерина в системе вакцинопрофилактики сальмонеллеза у телят 82
IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ 85
V ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ ? 95
- Этиология и патогенез сальмонеллезов
- Определение антагонистической активности споробактерина in vitro методом совместного культивирования
- Определение антагонистической активности споробактерина in vivo
Введение к работе
1.1 .Актуальность темы. Сальмонеллез, поражая преимущественно телят 10-30-дневного возраста, наносит значительный экономический ущерб хозяйствам (Архангельский И.И., Баданин Н.В., 1960; Ахмедов A.M., 1971; Маннапова Р.Т., 1996). Сальмонеллезный процесс, как сообщают В.П. Урбан и соавт. (1996), может протекать спорадически или с большим охватом поголовья, сопровождаясь высокой летальностью.
В системе противосальмонеллезных мероприятий основной упор делается на вакцинопрофилактику болезни (Корсакова Е.Н., 2001). При этом если телят получают от неиммунизированных коров, вакцинацию их проводят в 10-дневном возрасте, с последующей ревакцинацией через 10 дней. Телят, получивших колостральный иммунитет, прививают вакциной против паратифа (сальмонеллеза) в 20-дневном возрасте. Несмотря на такую тактику, сальмонеллез у телят имеет широкое распространение в хозяйствах Тюльган-ского и Октябрьского районов Оренбургской области (Данные отчетности РУВ за период 1990-2000 гг.).
В последние годы при лечении животных с преимущественным поражением пищеварительной системы, в том числе и инфекционной этиологии, используются пробиотики (Жданов П.И., 1994; Тараканов Б.В., 2000). Они содействуют восстановлению кишечного биоценоза, нарушенного болезнью.
Основываясь на положительном опыте применения споробактерина, изготовленого на основе В. subtilis, для профилактики болезней молодняка (Жданов П.И., 1994; Михин Г.Г., 1996; Старухин П.П., 1996; Романова О.В., Лютинский СИ., 2000), мы поставили перед собой:
1.2. цель - проверить эффективность применения споробактерина новорожденным телятам в системе вакцинопрофилактики сальмонеллезной инфекции в стационарно неблагополучных хозяйствах.
При реализации поставленной цели решались следующие задачи - ис-пытывалось антагонистическое действие споробактерина по отношению к S.
enteritidis - основному возбудителю сальмонеллеза у телят Оренбургской области. Проверялось антагонистическое действие в двух вариантах: in vitro -методом совместного культивирования обоих видов микроорганизмов на Ml lb' и методом штриховых посевов на среде Гаузе № 2; in vivo - на мышах при создании экспериментальной модели сальмонеллеза;
проверялась иммуномодулирующая роль споробактерина у кроликов при вакцинации их против сальмонеллеза;
определялась продолжительность курсов назначения споробактерина новорожденным телятам при вакцинации их против сальмонеллеза в 10-, 20-, 30- и 40-дневном возрасте;
изучались факторы неспецифической защиты организма месячных телят, а также динамика поствакцинальных антител при различных дозах и схемах предварительного назначения им споробактерина;
рассчитывалась экономическая эффективность применения споробактерина в системе вакцинопрофилактики сальмонеллеза у телят.
1.3. Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что,
во-первых, для получения прочного и продолжительного поствакцинального
противосальмонеллезного иммунитета предложено предварительное курсо
вое назначение споробактерина вакцинируемым телятам.
Во-вторых, научно обосновано проведение активной иммунизации телят против сальмонеллеза в 20-30-дневном возрасте, при условии ежедневного приема ими с молозивом (молоком) споробактерина.
В-третьих, созданы предпосылки для управления сальмонеллезным процессом в хозяйствах, стационарно неблагополучных по этой инфекции.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Учение об ин
фекционном и эпизоотическом сальмонеллезном процессах пополнилось но
выми данными, которые должны учитываться специалистами соответствую
щего профиля при разработке рекомендаций по специфической профилакти
ке данной болезни; при подготовке и переподготовке специалистов ветери
нарной медицины; при написании монографической литературы.
Многолетний опыт применения споробактерина в хозяйствах, разводящих крупный рогатый скот симментальской и красной степной пород, убедительно доказал, что это позволяет повысить устойчивость организма к болезням вообще и к сальмонеллезу, в частности, то есть воздействовать на третье звено эпизоотического процесса, разрывая эпизоотическую цепь.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: Международном симпозиуме «Социально-экономические, политические и экологические проблемы в сельском хозяйстве России и стран СНГ: история и современность» (Оренбург, 2004); Российской научно-практической конференции, посвященной 50-летию освоения целинных земель, 15-17 сентября 2004 года, г. Оренбург (Оренбург, 2004); расширенном заседании кафедр эпизоотологии и паразитологии, физиологии и патофизиологии ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» (2004), научных конференциях факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского ГАУ (2001-2004).
Публикации результатов исследований. По результатам исследований вышло 5 научных работ, опубликованных в материалах научно-практических конференций, симпозиумов и трудах научных учреждений.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
Споробактерин, изготовленный на основе В. subtilis шт. 534, обладает антагонистическим действием по отношению к S. enteritidis, что подтверждается экспериментами как in vitro, так и in vivo.
Споробактерин жидкий проявляет иммуномодулирующий эффект при вакцинации кроликов против сальмонеллеза.
При длительном (3-4-недельном) применении новорожденным телятам и телятам молочного периода споробактерин повышает устойчивость их организма к болезням, и позволяет получить более напряженный поствакцинальный иммунитет, т.е. воздействует на третье звено эпизоотической цепи.
4. При использовании споробактерина в системе вакцинопрофилактики сальмонеллеза телят на каждый вложенный рубль можно получить от 5 до 14 рублей дохода.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы, предложения производству, список литературы, который содержит 270 наименований, в т.ч. 78 - иностранных авторов. Работа изложена на 130 страницах компьютерной верстки, иллюстрирована 10 таблицами, 25 рисунками.
Этиология и патогенез сальмонеллезов
Сальмонеллезы (Salmonelloses) животных, паратифы, - инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных, птиц и человека, характеризующиеся при остром течении лихорадкой и расстройством функции кишечника, при хроническом - также воспалением легких. Сальмонеллезы относятся к числу зоонозов, чрезвычайно распространенных в России и во многих странах мира. Различают первичные сальмонеллезы (паратифы), характеризующиеся клиническими признаками, свойственными тому или иному виду животных, и вызывающиеся определенными видами Salmonell, и вторичные сальмонеллезы, которые наслаиваются на основное заболевание и осложняют его (парагрипп, пастереллез и др.), при этом характерные для сальмонеллезов клинические признаки обычно слабо выражены или отсутствуют (Антонов В.Я., Блинова П.Н., 1971; Салаутин В.В., 2004).
Возбудители сальмонеллезов - относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella. Это прямые, грамотрицательные палочки длиной 2-5 мкм, шириной 0,7-1,5 мкм. Обычно подвижные (исключение Sal. pullorum и Sal. gallinarum). Факультативные анаэробы. Редуцируют нитраты. При росте на средах с глюкозой сальмонеллы обычно выделяют газ (исключение - некоторые штаммы Sal. choleraesuis). Уреазоотрицательные, обычно не ферментируют сахарозу, инозит, салицин. Большинство штаммов утилизируют цитрат натрия. Продуцируют лизиндекарбоксилазу (исключение -Salmonella paratyphi А) и орнитиндекарбоксилазу (исключение - Sal.typhi). Культуры в R- и S- форме могут иметь различия биохимических и серологических свойств. На МПА образуют прозрачные колонии с голубоватым оттенком, диаметром 2,4 мм. На агаре Эндо - колонии бледно-розовые, прозрачные, на агаре Плоскирева - бесцветные, непрозрачные, на среде Левина -прозрачные, с фиолетовым оттенком. Наиболее характерный рост отмечается на селективной для Salmonell среде - висмут-сульфит-агаре, где они образуют черные колонии с металлическим блеском. В ряде случаев, особенно при выделении от животных с подозрением на хроническое течение сальмонеллеа, первичные посевы проводят на одну из сред накопления - Кауфмана,
Мюллера, Киллиана, селенитовую, магниевую. По ферментативной активно сти сальмонеллы условно подразделяются на подроды (I, II, III, IV, V), кото рые в определенной степени соответствуют видам и подвидам других микро организмов. Подавляющее большинство выделенных от животных Salmonell входят в подрод I (Sal. choleraesuis, Sal. typhimurium, Sal. abortusovis, Sal. ty phisuis и др.). В подрод III включена группа микроорганизмов, ранее состав ів ; лявших отдельный род Arisone, отличительной особенностью которых явля ется способность ферментировать лактозу и наличие В-галактозидазы. Штаммы этого подрода могут быть выделены от различных видов сельскохо зяйственных животных. Для полной идентификации Salmonell необходима серологическая типизация по О- и Н - антигенам в реакции агглютинации с поливалентными групповыми О - сыворотками и с монорецепторными О- и Н - сыворотками (Маннапова Р.Т., 1996; Яцышина СБ. и соавт., 2004; Лу ковников Е.А., Парфенов А.Ф., 2004). О - антиген (соматический) представляет собой термостабильный ли пополисахаридно-белковый комплекс. Жгутиковые Н-антигены термола щ/ бильны, состоят из белка и делятся на два вида: 1-фазы, обладающие специ фическими свойствами. 2-й фазы, обладающие неспецифическими свойства ми, характерными для различных типов Salmonell. Некоторые сальмонеллы содержат Vi - антиген и поверхностные К-антигены. На основании общности соматических антигенов, обозначенных арабскими цифрами (1, 2, 3, 4 и т.д.), сальмонеллы объединены в серологические группы, символизируемые бук вами латинского алфавита (А, В, С и т.д.). Дифференциация вариантов внут ри группы осуществляется по Н-антигенам, причем 1-я фаза обозначается строчными буквами латинского алфавита (а, Ь, с и т.д.), а 2-я фаза - арабски Щ ми цифрами и строчными буквами латинского алфавита (схема Кауфмана Уайта) (Bergeys, 1936; Цион Р.А., 1949; Bergeys, 1980; Bergeys, 1984-1989). Род Salmonella объединяет более 2200 серовариантов, которые разделены по антигенному родству на 52 серогруппы. В пределах каждого серова-ра сальмонеллы подразделяются на биовары, фаговары. Кроме того, они различаются по характеру продуцируемого бактериоцина и по устойчивости к действию определенных антибиотиков, что имеет значение при внутрисеро-вариантной дифференциации. Большинство выделяемых сероваров патогенны для различных видов животных, птиц и человека (Антонов Б.И., Борисова В.В., Волкова П.М. и соавт., 1986; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995; Маннапова Р.Т., 1996; Житенко П.В., Боровков М.Ф., 1999).
По данным В.А. Ковылиной (1952), сальмонеллы в организме продуцируют эндотоксины, которые вызывают энтериты, а при снижении устойчивости организма - токсемию. Работая с культурами Salmonella enteritidis, она получила токсин, который обладает значительной терморезистентностью и сохраняет свои токсические свойства после 30-минутного кипячения. При внутрибрюшинном введении нефильтрованного токсина в дозе 0,05-0,2 мл белые мыши погибают через 18-24 часа, морские свинки от дозы 0,5-1,0 мл -через 24-36 часов, кролики от дозы 0,3-1,0 мл (в вену) - через 20-36 часов. Действие токсина при подкожном введении значительно слабее и полностью отсутствует при пероральном назначении. Фильтрация через асбестовые пластины в значительной степени адсорбирует ядовитые продукты экстракта, с уменьшением токсичности в 10 раз.
Определение антагонистической активности споробактерина in vitro методом совместного культивирования
Из данных таблицы 3, следует, что наибольшая зона (11,5 мм) задержки роста сальмонелл сформировалась в чашках, в которых предварительное подращивание В. subtilis велось в течение 48 часов. Несколько меньше (9,5 мм) этот результат оказался в пробах после суточного подращивания В. subtilis. Важно отметить, что в этот временной отрезок коэффициент вариации и коэффициент точности результатов были наименьшими, соответственно составляя 14,64 и 5,98%. Третий результат по рассматриваемому параметру был при 18-часовой экспозиции - 6,9 мм, а наименьший (4,99 мм) - при 60-часовом подращивании В. subtilis.
Все эти факты могут свидетельствовать о том, что В. subtilis в процессе роста выделяет в питательную среду продукты своей жизнедеятельности, которые сдерживают развитие S. enteritidis, т.е. оказывают антагонистическое действие. Динамика накопления этих веществ такова, что к 18 часам культивирования появляются первые порции. За последующие 6 часов (к 24 часам от посева) их становится на 37,7% больше, а по прошествии еще одних суток прибавка составляет 21,1% к предыдущему значению. К 60 часам уровень этих веществ, поступивших в среду Гаузе, снижается в 2,3 раза против 48-часового. Иначе говоря, специфическое действие продуктов, выделенных В. subtilis, ограничено во времени двумя сутками. Стало быть, при отработке схем применения споробактерина животным, следует предусмотреть либо ежедневное, либо с интервалом не более 2-х суток, назначение его в течение длительного (20-30 суток) времени.
Определение антагонистической активности В. subtilis in vivo Получив обнадеживающие результаты по антагонистическому действию В. subtilis в отношении S. enteritidis in vitro, мы решили проверить антагонизм в организме мышей, искусственно заразив их летальными дозами (LDJOO) сальмонелл. Для достижения поставленной цели под опыт взяли 40 беспородных мышей, массой 16 граммов каждая. Их разделили на четыре равные группы, и всем внутримышечно ввели стандартизированную дозу сальмонелл, способную вызвать гибель 95-100% мышей на 4-5-е сутки. Для изучения лечебно-профилактического действия споробактерина трем группам мышей (1-я, 2-я и 3-я) 10 суток подряд, подкожно вводили взвесь В. subtilis в 1% растворе натрия хлорида, содержащую 200 млн. спор. В первой опытной группе начало курса назначения споробактерина приурочили ко дню заражения мышей.
Определение антагонистической активности споробактерина in vivo
По достижении животными месячного возраста, у них отбирались пробы крови для гематологических анализов и установления фагоцитарной активности нейтрофилов, а также сыворотки крови - для определения биохимических показателей и гуморальных факторов неспецифической защиты. Кроме того, с помощью РА у подопытных животных определялся титр противосальмонеллезных антител непосредственно перед вакцинацией, а потом спустя 10, 30,60 и 90 суток после нее.
В частности, из них следует, что оба изучаемых нами показателя красной крови у животных, получавших споробактерин, были существенно выше (р 0,001), чем у телят контрольной группы. Существует прямая зависимость между продолжительностью поступления препарата в организм животных до вакцинации и количеством у них эритроцитов в единице объема крови. Так, 10-дневный курс назначения споробактерина (первая опытная группа), привел к абсолютному увеличению количества эритроцитов на 0,44 Т/л. При 20-дневном курсе (вторая опытная группа) прирост уже составил 0,69 Т/л, а при 30-дневном (третья опытная группа) - 0,86 Т/л. Статистический анализ межгрупповых различий у представителей опытных групп показывает, что они существенны в парах: первая-вторая (р 0,05), первая-третья (р 0,001), но недостоверна в паре вторая-третья (р 0,05). Важно отметить, что количество эритроцитов у телят опытных групп характеризуется особой выравненностью, о чем свидетельствуют коэффициенты точности (Cs) и вариации (Су).
Анализ данных по содержанию гемоглобина в эритроцитах у подопытных телят согласуется с выявленной закономерностью в отношении динамики количества эритроцитов и продолжительности дачи споробактерина. А именно, чем меньше продолжительность курса назначения споробактерина невакцинированным животным, тем слабее выражена гемогло-бинизация эритроцитов (первая опытная группа) и наоборот. Сравнивая результаты животных опытных групп, находим, что они различаются на уровне: первая-вторая (р 0,02), первая-третья (р 0,001), вторая-третья (р 0,001) группы. Самые низкие коэффициенты Cs и Су по этому показателю отмечаются у телят контрольной группы, а самые высокие - у представителей первой опытной группы. Это может означать, что у первых из них отдельно взятые варианты совокупности ближе всего к средней арифметической, а у вторых - они имеют больший разброс.
Что же касается общего количества лейкоцитов в единице объема крови, то оно менялось в прямо противоположном направлении. В частности, максимум численности лейкоцитов в месячном возрасте отмечен у контрольных телят, а минимум - у особей третьей опытной группы, которые в течение месяца с молозивом (молоком) получали ежедневно по 10 мл спо-робактерина. Разница существенна на третьем уровне не только между анализируемыми группами, но и между остальными опытными группами и контролем. Есть она и в разрезе опытных групп: первая-вторая (р 0,001), первая-третья (р 0,001), и вторая-третья (р 0,001). По мере нарастания коэффициента вариации (Су) рассматриваемого показателя группы животных можно расположить в следующей последовательности: первая, четвертая, третья и вторая.
На основании полученных результатов, мы полагаем, что в процессе вегетации спор В. subtilis и транслокации микроорганизмов, выделяются факторы, которые действуют на полипотентные клетки II и III классов (лимфоцитопоэза, миелопоэза, эритроидного ростка), оптимизируя их функцию. В условиях относительно ранней встречи (10 суток) таких животных с вакцинным антигеном (первая группа) корригирующая роль спо-робактерина проявляется в меньшей степени. И наоборот, при встрече в 20-30-дневном возрасте (2-я - 3-я группы) этот эффект выражен лучше. Очевидно, это может свидетельствовать о функциональной незавершенности иммунной системы на ранних этапах постнатального онтогенеза.