Введение к работе
Актуальность проблемы
Фактор свертывания крови VIII (FVIII) - это неэнзиматический кофактор фактора ГХа, который при протеолитической активации образует с фактором ГХа плотный нековалентный комплекс, связывающий и активирующий фактор X. Данный комплекс является основным элементом петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови. Дефекты гена FVIII могут приводить к развитию гемофилии А - Х-связанного рецессивного генетического заболевания с частотой встречаемости около 1 случая на 5000 мужчин. Единственной эффективной терапией гемофилии А является регулярно проводимая заместительная терапия лекарственными препаратами FVIII. Традиционный источник FVIII - это донорская плазма крови, количество которой ограничено. Ее использование в качестве сырья для получения терапевтических белков связано с риском передачи пациентам вирусных и прионных инфекций. Рекомбинантный FVIII человека (rhFVIII) для терапии гемофилии А может быть получен при помощи культивируемых клеток млекопитающих. Допущенные к медицинскому применению варианты rhFVIII секретируются трансфицированными клетками яичника китайского хомячка (СНО) или почки новорожденного хомячка (ВПК) и полностью эквивалентны FVIII из донорской плазмы при проведении заместительной терапии.
Основным недостатком существующих методов получения rhFVIII является крайне низкий уровень экспрессии, вызванный большим размером целевого белка и сложным набором пост-трансляционных модификаций. При удалении домена В, составляющего значительную часть молекулы FVIII, удельная прокоагулянтная активность FVIII и его период полураспада в плазме крови практически не падают. Замена домена В на короткий линкерный пептид, обозначаемый как SQ, приводит к существенному увеличению уровня продукции FVIII в клетках СНО и почти полному протеолитическому процессингу белка-предшественника до зрелой двухцепочечной формы. Медицинский препарат rhFVIII с делецией домена В (FVIII BDD SQ) допущен к медицинскому применению, его показатели эффективности и безопасности аналогичны таковым для препаратов полноразмерного rhFVIII. Типичные опубликованные уровни продуктивности для клеток линии СНО, продуцирующих FVIII BDD SQ, составляли 0,5-2 МЕ/мл, что соответствует концентрации FVIII около 0,2 мкг/мл и на несколько порядков уступает продуктивности промышленных продуцентов других рекомбинантных факторов свертывания крови (VII, IX).
Создание новых генетических конструкций для гетерологичной экспрессии биотехнологически важных белков имеет не только прикладное, но и фундаментальное
значение. Современные подходы, связанные с дизайном регуляторных последовательностей гена, кодирующего интересующий белок, позволяют существенно улучшить уровень экспрессии последнего. Получение линий клеток-продуцентов с существенно большим уровнем секреции биологически активного rhFVIII является актуальной практической задачей, результаты решения которой будут востребованы современной биофармацевтикой и могут быть использованы для получения промышленно пригодных систем экспрессии других фармацевтически значимых белков.
Цель работы и основные задачи исследования:
Основной целью работы была демонстрация возможности получения клональной клеточной линии-продуцента rhFVTII с высокой продуктивностью и характеризация ее основных свойств. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать динамику продуктивности клеточных популяций, экспрессирующих гены полноразмерного rhFVIII и делеционного варианта BDD SQ под контролем промотора CMV.
-
Разработать специализированный плазмидный вектор, позволяющий существенно повысить уровень экспрессии гена rhFVTII.
-
Получить клональные линии-продуценты rhFVIII с продуктивностью более 10МЕ/мл при помощи разработанного вектора.
-
Исследовать основные свойства линий-продуцентов и разработать варианты лигандов для аффинной очистки rhFVTII.
Научная новизна: В результате проведения настоящей работы обнаружено, что уровень секреции клетками-продуцентами делеционного варианта rhFVTII в безбелковую культуральную среду значительно выше уроня секреции полноразмерного rhFVIII, при этом процесс амплификации трансгена rhFVIII в геноме клеток-продуцентов для генетической конструкции на основе промотора CMV идет с низкой эффективностью даже при объединении открытых рамок считывания целевого гена и селекционного маркера в составе бицистронной РНК. Было продемонстрировано, что использование нетранслируемых и фланкирующих областей гена фактора элонгации трансляции 1А (EEFJAJ) китайского хомячка вместо вирусного промотора CMV позволяет существенно увеличить уровень экспрессии rhFVTII в стабильно трансфицированной культуре клеток. Включение в состав экспрессионного вектора конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр (EBV) дает возможность увеличивать уровень экспрессии гена rhFVTII более чем в 10 раз при амплификации генетической кассеты в геноме клеток. Были впервые получены линии-продуценты делеционного варианта rhFVTII с
продуктивностью 30-40 МЕ/мл при простом периодическом культивировании клеток в безбелковой среде, не использующие ко-экспрессию шаперона rhFVTn или реинжиниринг сигнальных путей и ферментных систем продуцентов. Было продемонстрировано, что лиганды для аффинной очистки rhFVIII могут бьггь получены как созданием моноклональных антител, так и докингом in silico библиотек химических соединений.
Теоретическая и практическая ценность: Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию процессов биосинтеза и секреции FVHI гетерологичными клетками. Полученные результаты могут бьггь использованы для создания линий-продуцентов различных фармацевтически значимых белков и методов генотерапии гемофилии А.
Апробация работы: Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на I Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2009» (Турция, Анталия, 25-27 мая 2009), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012), 16й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 16-21 апреля 2012), Международной конференции «Биология-наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012), на 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, материалов российских и международных конференций - 6. Оформлено 2 патента.
Структура и объем работы: Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных
