Введение к работе
Актуальность темы
Разработка безопасной и эффективной вакцины против ВИЧ-1 является приоритетной задачей мирового здравоохранения. Прошло более 25 лет с момента идентификации вируса иммунодефицита человека. За это время в мире было инфицировано ВИЧ-1 почти 70 миллионов человек и около 30 миллионов инфицированных уже умерли. Очевидно, что создание вакцины против ВИЧ-1 позволило бы сдержать развитие пандемии СПИДа. Работы по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции активно ведутся и в России, и за рубежом.
Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против различных патогенов весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. Принцип ДНК-вакцинации активно используется для разработки вакцин против ВИЧ-1. К настоящему времени уже получен ряд кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-1 и показана способность таких вакцин индуцировать вирус-специфический иммунный ответ как на лабораторных животных, так и в процессе клинических испытаний.
В то же время эксперименты по ДНК-вакцинации обозначили определенные проблемы. Одна из них связана с низкой иммуногенностью ДНК-вакцин, в результате чего при внутримышечных инъекциях для достижения достаточно высокого иммунного ответа приходится вводить значительные количества плазмидной ДНК. Это обстоятельство предполагает поиск альтернативных путей доставки ДНК-вакцин, способных обеспечить высокий специфический иммунный ответ при малой дозе вводимой ДНК.
Рядом авторов показано, что одним из перспективных способов доставки ДНК-вакцин могут служить аттенуированные штаммы сальмонелл. Множество работ в этом направлении объясняется хорошей изученностью аттенуированных штаммов, полученных при создании живых мукозальных вакцин перорального применения против сальмонеллеза и брюшного тифа.
Актуальность создания мукозальной вакцины против СПИДа обусловлена тем, что значительная часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте, поэтому вакцина против вируса должна обеспечивать защиту одновременно как в слизистых в области проникновения вируса, так и при передаче
4 вируса через кровь. Преимущество непарентерального способа ДНК-вакцинации с использованием аттенуированных сальмонелл по сравнению с инъекционным заключается в том, что при непарентеральном введении ДНК-вакцины в составе бактериального вектора, помимо системного гуморального и клеточного ответа, активируется и специфический мукозальный иммунитет, создающий барьер для проникновения вируса в организм. При использовании данного подхода не требуется проведения дорогостоящей стадии очистки ДНК-вакцины или антигена Кроме того, инъекционный способ введения технически более сложен, что особенно важно при планировании массовых иммунизации, охватывающих группы риска.
Если сравнивать пероральный и перректальный способы введения вакцины, то перректальный способ предпочтителен по двум причинам. Первая заключается в том, что слизистая кишечника является местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса. Следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в «воротах» инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый рН желудка, либо других способов защиты действующего начала, как это необходимо в случае перорального введения.
В данной работе в качестве вектора доставки ДНК-вакцины был использован штамм Salmonella enteritidis Е23, созданный в Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова (Бойченко и др., 1994). Штамм был аттенуирован путем введения делеций в генах аденилатциклазы и цАМФ-рецепторного белка. В результате таких модификаций патогенность S. enteritidis Е23 была снижена по сравнению с родительским штаммом более, чем в 105 раз.
Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была получена рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI (анти-ВИЧ-1 ДНК-вакцина). Плазмида содержит искусственный ген, кодирующий полиэпитопный белок TCI, состоящий из 80 ЦТЛ эпитопов, входящих в состав белков вируса ВИЧ-1 субтипов А, В и С. С помощью трансформации плазмидой pcDNA-TCI клеток штамма S. enteritidis Е23 был получен рекомбинантный штамм 5. enteritidis E23/pcDNA-TCI. На основе этого штамма разработана кандидатная анти-ВИЧ-1 вакцина СалВИЧ «Д» в виде ректальных суппозиториев.
5
В то же время ряд вопросов, касающихся биологических свойств S. enteritidis
E23/pcDNA-TCI, остался неизученным, в связи с чем потребовались дальнейшие
углубленные исследования в этом направлении. К ним относятся вопросы,
связанные с наличием у рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-
TCI вирулентных, токсических и токсигенных свойств, исследование
иммуногенности и персистенции штамма в организме лабораторных животных при его введении в виде ректальных суппозиториев.
Цель данной работы заключалась в характеризации рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследовании его иммуногенных свойств при перректальном введении в составе суппозиториев.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Оценить влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимические и антигенные свойства штамма S. enteritidis Е23.
-
Изучить сохранность плазмиды pcDNA-TCI в клетках аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.
-
Изучить вирулентность, токсичность и токсигенность штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI для теплокровных животных.
-
Изучить длительность персистенции аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм.
-
Исследовать возможность экспрессии гена TCI в клетках пейеровых бляшек при введении суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм S. enteritidis Е23/ pcDNA-TCI.
-
Изучить интенсивность ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа у лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.
Научная новизна и практическая ценность
-
Впервые установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных.
-
В ходе исследования персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis 2i/pcDNA-TCI показано, что данный штамм, также как и штамм S. enteritidis Е23, обладает ограниченной способностью к персистенции в организме млекопитающих. Установлено, что бактерии обоих исследованных штаммов не обнаруживаются в селезенке иммунизированных животных через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения суппозиториев.
-
Впервые показано, что перректальное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих лиофилизированные клетки штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, обеспечивает доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.
4. Впервые показано, что после иммунизации лабораторных мышей штаммом
5. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев происходит формирование как
системного Т-клеточного иммунного ответа, так и гуморального иммунного ответа,
что выражалось в появлении специфических IgG и IgA в сыворотке крови против
белков ВИЧ-лизата и рекомбинантного белка TCI. Схема иммунизация, основанная
на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, была более эффективной, чем
на однократном введении.
Результаты настоящих исследований могут представлять интерес с точки зрения практического применения. Был получен ряд дополнительных характеристик, которые позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для дальнейшей разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СалВИЧ «Д». На основании полученных данных можно рекомендовать штамм S. enteritidis Е23 в качестве вектора доставки других ДНК-вакцин против вирусных, бактериальных инфекций, онкологических заболеваний. Возможно также рекомендовать использование штамма S. enteritidis Е23 для доставки биологически активных белков (например, цитокинов) в случаях, когда необходимо активировать местный иммунитет слизистой.
7 Основные положения, выносимые на защиту:
-
Введение плазмиды pcDNA-TCI в клетки аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 не влияет на биохимические и антигенные свойства штамма.
-
Штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI невирулентен, малотоксичен и нетоксигенен для теплокровных животных.
-
Суппозитории, содержащие рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, при перректальном введении лабораторным мышам обеспечивают доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.
-
Иммунизация мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает формирование системного Т-клеточного иммунного ответа и появление специфических IgG и IgA антител в сыворотке крови против антигена TCI.
-
Повторное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, приводит к усилению иммунного ответа на антиген TCI.
Апробация работы и публикации
По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, две из которых - в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург, 2008 г; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г; Keystone Symposia Global Health Series. HIV Vaccines: Progress and Prospects, Banff, Alberta, Canada, 2008 г; 3-ей конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2009 год; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2010 г.
8 Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (216 наименований).
Личный вклад автора
Все основные эксперименты, включая исследование биохимических, антигенных и иммуногенных свойств штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, оценку стабильности ДНК-вакцины in vitro и vivo, исследование длительности персистенции в организме животных, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, а также анализ полученных результатов выполнены автором лично. Постановка ELISpot была проведена совместно с с.н.с. ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Каплиной О.Н. Исследования патогенности штаммов S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI проводились совместно с сотрудниками Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) ФМБА РФ.
