Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Вирус гриппа. Общие сведения 10
1.1.1 Строение вириона 10
1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа 10
1.2. Белки вируса гриппа 12
1.2.1 Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА) 12
1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа- гемагглютинин и нейраминидаза 12
1.2.3 Нуклеопротеин (NP) 19
1.2.4 Ml и М2 белки 20
1.2.5 Неструктурные белки 20
1.3 Специфический иммунитет к вирусу гриппа и ЖГВ 21
1.3.1 Гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа и ЖГВ 22
1.3.2 Клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа и ЖГВ 24
1.3.3 Методы оценки гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию 25
1.3.4 Морская свинка как модель для изучения противогриппозного иммунитета 28
1.4 Свойства вируса гриппа, которые могут повлиять на иммуногенность гриппозных
вакцин 30
1.4.1 Температурочувствительность «диких» вирусов, ее возможные механизмы 31
1.4.2 Влияние ts-фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины 32
1.4.3 Ингибиторочувствительность «диких» вирусов, ее природа и возможные механизмы 34
1.4.4 Связь ингибиторочувствительности с иммуногенностью 37
1.4.5 Связь рецепторной специфичности с иммуногенностью 39
1.5 Кодонная оптимизация как способ повышения иммуногенности 43
1.5.1 Теоретические основы оптимизации кодонного состава 43
1.5.2 Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин 45
1.5.3 Повышение иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава 47
1.6 Заключение к обзору литературы 50
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1 Вирусологические методы 51
2.2 Методы работы с лабораторными животными 55
2.3 Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа 55
2.4 Молекулярно-биологические методы 57
2.5. Методы компьютерного моделирования
2.6 Методы статистической обработки 62
Глава 3. Результаты 63
3.1 Отработка модели для постановки опытов по исследованию показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа 63
3.1.1 Сравнительный анализ патогенетических особенностей гриппозной и вакцинальной инфекций у морских свинок 63
3.1.2 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах 67
3.1.3 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с одиночными кодирующими мутациями в гемагглютинине 70
3.1.4 Заключение 71
3.2 Влияние ингибиторочувствительности штамма вируса гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок 72
3.2.1 Сравнение ингибитороустойчивого и ингибиторочувствительного вариантов вируса A/Singapore/1/57 (H2N2), имеющих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютинина, в экспериментах in vitro и in vivo 72
3.2.2 Показатели гуморального иммунного ответа после заражения морских свинок вариантами вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) в экспериментах in vivo 75
3.2.3 Характеристика 7:1 и 6:2 реассортантов, унаследовавших неираминидазу от ИЧ или ИУ вируса-родителя 78
3.2.4 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и
6:2 реассортантами на основе вируса гриппа A/California/7/2004 (H3N2) 81
3.2.5 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и
6:2 реассортантами на основе вируса гриппа B/Wisconsin/1/2010 84
3.2.6 Заключение 87
3.3 Отдельные аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина и их влияние на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами 88
3.3.1 Гетерогенность в аминокислотном составе гемагглютинина популяции дикого вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и клетках MDCK 88
3.3.2 Картирование аминокислотных отличий в гемагглютинине клонов дикой популяции A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинных реассортантов, подготовленных на их основе 91
3.3.3 Показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок, вакцинированных штаммами, подготовленными на основе вариантов вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1), имеющих одиночные аминокислотные отличия в гемагглютинине 93
3.3.4 Заключение 96
3.4 Влияние оптимизации кодонного состава гемагглютинина на свойства вирусов гриппа и показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo 97
3.4.1 Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе 97
3.4.2 Фенотипические свойства вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине 101 3.4.3 Показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов H1N1 и H5N1 с
измененным составом кодонов в гемагглютинине в экспериментах in vivo 106
3.4.4 Отработка методики получения вакцинных штаммов ЖГВ на основе штаммов для инактивированной вакцины (PR8 реассортантов) 108
3.4.5 Реассортация вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 112
3.4.6 Заключение 115
3.5 Связь фенотипических признаков «диких» родительских вирусов с иммуногенностью вакцинных штаммов, подготовленных на их основе:
ретроспективный анализ данных клинических испытаний живой гриппозной вакцины 116
3.5.1 Влияние -фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины 116
3.5.2 Влияние ингибиторочувствительности «дикого» родительского 119
3.5.3 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ 120
3.5.4 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на выраженность клинических реакций при введении ЖГВ 121
3.5.5 Заключение 122
Глава 4. Обсуждение результатов 123
Раздел 3. Заключение 138
Выводы: 139
Благодарность 140
Список основных сокращений 141
Список иллюстративного материала
- Поверхностные белки вируса гриппа- гемагглютинин и нейраминидаза
- Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа
- Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах
- Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе
Поверхностные белки вируса гриппа- гемагглютинин и нейраминидаза
Строение гемагглютинина. Гемагглютинин вируса гриппа представляет собой интегральный белок липидной оболочки вируса. Он обеспечивает специфическое распознавание рецепторов, прикрепление вирусной частицы к рецепторам на поверхности клетки и плавление мембраны эндосомы для обеспечения выхода вирусной частицы в цитоплазму клетки [297].
Гемагглютинин - гомотример, трансмембранный гликопротеин I типа, цилиндрической формы, размером примерно 135 А в высоту и 35-70 А в радиусе. Каждый мономер состоит из глобулярной головки и ножки, в негликозилированной форме молекулярная масса мономера около 60 кДа. Глобулярный домен полностью принадлежит субъединице НА1, ножка состоит из частей, принадлежащих как субъединице НА1, так и субъединице НА2 [299]. До расщепления на цепи НА1 и НА2 каждый мономер представляет собой единую цепь НАО. В процессе синтеза НАО котрансляционно транспортируется в эндоплазматический ретикулум, затем через систему цистерн комплекса Гольджи транспортируется на плазматическую мембрану. НАО расщепляется на субъединицы НА1 (327 аминокислот) и НА2 (222 аминокислоты), соединенные дисульфидными мостиками. Свободные концы в сайте расщепления (С-конец НА1 и N-конец НА2) отстоят друг от друга на расстояние 20 А. В молекуле НАО в сайте расщепления большая часть вирусов гриппа содержит остаток аргинина, у высокопатогенных штаммов птичьего гриппа в данном участке располагается ряд остатков положительно заряженных аминокислот [303].
Каждый мономер заякорен в мембране спирально уложенным трансмембранным пептидом длиной 27-28 аминокислот, расположенным в области С-конца каждой из цепей НА2, последние 10 аминокислот формируют короткий участок, расположенный в цитозоле [346].
Глобулярные участки гемагглютинина сформированы аминокислотными остатками НА1 116 -261, уложенными в «jelly-roll»-MOTHB из 8 антипараллельных слоев. Дистальные концы глобулярных участков содержат высококонсервативные рецептор-связывающие карманы, вокруг которых располагаются высоко вариабельные антигенные сайты [167, 340]. Оставшиеся части НА1 входят в структуру ножки в основном в составе Р-слоев. НА2, которая формирует основную часть ножки, уложена преимущественно в спиральную структуру длиной 80 А. Первые 20 аминокислот субъединицы НА2 представляют собой гидрофобный пептид слияния, необходимый для выхода вируса из эндосомы [167]. Строение пептида слияния является важной детерминантой патогенности вируса гриппа и мутации в данной области влияют на фузогенную активность гемагглютинина и, соответственно, эффективность запуска инфекционного цикла вируса [347]. Пептид слияния богат глицином, что обеспечивает достаточную гибкость в данном участке При нейтральном рН, N-концы пептидов слияния расположены в пространстве между субъединицами тримера в трансмембранном участке. При снижении рН участок претерпевает конформационные изменения, необходимые для установления контакта между гидрофобными областями мембраны эндосомы и молекулы гемагглютинина [167].
N-связанные олигосахариды, оказывающие значительное влияние на функции гемагглютинина, обнаружены в глобулярном домене и в ножке тримера. В глобулярной части расположение сайтов гликозилирования вариабельно, в ножке, как в субъединице НА1, так и в субъединице НА2 - более консервативно [288, 328].
Рецепторний карман. Рецепторный карман вируса гриппа, расположенный в глобулярной части, служит для специфического распознавания рецепторов на клеточной поверхности и связывания с ними. Клеточными рецепторами вируса гриппа являются терминальные остатки сиаловой кислоты [340]. Рецепторный карман сформирован петлями 120, 130, 150, 220 и спиралью 190 [242]. Аминокислотные остатки, формирующие рецепторный карман вируса гриппа, консервативны среди разных подтипов вируса гриппа. Структурные исследования позволили установить роль отдельных аминокислотных остатков во взаимодействии с рецептором в рецепторном кармане: на рисунке 1 видно ориентацию остатка сиаловой кислоты в рецепторном кармане, показаны водородные связи между молекулой сиаловой кислоты и аминокислотными остатками рецепторного кармана [216].
Схематическое изображение рецептор-связывающего сайта гемагглютинина, взаимодействующего с аналогом рецептора вируса гриппа с указанием ключевых позиций, участвующих во взаимодействии с рецептором и водородных связей между отдельными аминокислотными остатками и аналогом рецептора. Желтым показан остаток сиаловой кислоты, серый - участки молекулы гемагглютинина. Красным показаны атомы кислорода, темно-синим - атомы азота. Водородные связи обозначены пунктирными линиями. Иллюстрация из статьи [216]
Консервативный остаток серина 136 формирует водородную связь с карбоксильной группой, которая также соединена водородной связью с амидом пептидной связи 137, гистидин 183 и глутаминовая кислота 190 формируют водородные связи с 9-гидроксильной группой, тирозин 98 соединен водородной связью с 8-гидроксильной группой. 5-ацетамидо азот формирует водородную связь с пептидной связью 135, и метильная группа данного остатка участвует в Ван-дер-Ваальсовом взаимодействии с 6-членным кольцом триптофана 153. 7-гидроксильная группа и ацетамидокарбонил водород связаны водородной связью и формируют Ван-дер-Ваальсово взаимодействие с остатком лейцина 194 [297, 340]. Участие данных функциональных групп во взаимодействии подтверждено структурными исследованиями [340], а также исследованиями свойств белков с мутациями в ключевых аминокислотных позициях [131]. На связывание с эритроцитами влияли замены только в трех из перечисленных аминокислотных позиций: Y98F, H183F, и L194A. Эти результаты подтверждают важность водородной связи 1уг с 8-гидроксильнои группой сиаловои кислоты и неполярныи контакт Leu с N-ацетил-метильной группой. His формирует водородные связи с Туг , а также с 9 гт, 153 т 195 і гидроксильнои группой сиаловои кислоты. 1гр и lyr , формирующие часть сети водородных связей, наряду с His и Туг , могут быть замещены фенилаланином, вследствие чего наступает только частичное ингибирование связывания [297].
Гемагглютинин вируса гриппа имеет специфичность к связи, которой остаток сиаловои кислоты соединен с остатком галактозы. В природе встречаются два основных типа связи: Neu5Ac-(2,3)-Gal и Neu5Ac-(2,6)-Gal. Гемагглютинины разных подтипов вирусов имеют разное сродство к этим связям: вирусы гриппа птиц присоединяются преимущественно к остаткам, присоединенным а-2,3 связью, вирусы гриппа человека предпочитают а-2,6 связь [279]. За смену рецепторной специфичности вирусов Н2, НЗ, Н6 отвечают аминокислотные остатки в позициях 226 и 228 [98], у вирусов подтипа H1N1 - остатки 190 и 225 [126], у вирусов гриппа В - аминокислотный остаток 198 [335]. Структурные исследования показали, что, хотя аминокислоты в указанных позициях не взаимодействуют с остатком сиаловои кислоты напрямую, при возникновении аминокислотных замен в ключевых позициях изменяется конформация рецептор-связывающего кармана, что изменяет аффинность к рецептору [278].
Антигенные сайты НА. Вокруг консервативного рецепторного кармана расположена высоко вариабельная область, постоянно изменяющаяся под действием иммунного пресса -антигенные сайты гемагглютинина [297]. У вирусов подтипа H3N2 описаны антигенные сайты А, В, С, D, Е [357]. Для вирусов подтипа НІ описано 4 основных антигенных сайта в головке гемагглютинина - Са, Cb, Sa и Sb [94, 242]. У пандемического вируса A/California/07/09 в состав антигенного сайта Sa входит 13 аминокислот, Sb - 12, Са - 19 аминокислот, СЬ - 6. На рисунке 2 показано расположение основных антигенных сайтов в молекуле гемагглютинина подтипа HI.
В состав антигенных сайтов входят аминокислотные остатки, локализованные в глобулярной части молекулы гемагглютинина, формирующие ее поверхность. Общей чертой антигенных сайтов является петлеобразная структура, изменения в которой возможны без влияния на остальные части молекулы гемагглютинина, а также наличие сайтов гликозилирования [297]. Присоединение олигосахаридов позволяет уйти от воздействия иммунного ответа. Это может происходить двумя путями: во-первых, часть поверхности гемагглютинина покрыта углеводными цепями, приобретенными в клетке хозяина, которые являются для организма «своими» и маскируют вирусный белок ; во-вторых, в процессе антигенного дрейфа отдельные сайты гликозилирования исчезают, другие появляются, что сильно изменяет поверхность гемагглютинина.
Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа
Животные. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» [48] и была одобрена Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ». В работе использовались морские свинки (самки-альбиносы) весом 300-350 г. полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Ленобласть, Всеволожский район, Рапполово). Животные содержались в стандартных крысиных клетках при температуре 22С и относительной влажности 25%, имели свободный доступ к пище и воде. Регистрацию температуры и влажности в помещении вивария осуществляли с помощью беспроводной погодной станции Oregon Scientific, модель BAR388HG (Китай). Всего в работе было использовано 150 морских свинок.
Схема оценки показателей гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo. Для исследования иммуногенности разных штаммов вируса гриппа животных заражали интраназально вируссодержащим материалом автоматической микропипеткой по 100 мкл в каждый носовой ход без анестезии (не меньше 3-х особей на группу). Животные получали вирус в дозе 5 lg ЭИД50 на одну особь. Группа «плацебо» получала в том же объеме стерильный физиологический раствор. На 14, 28 и 56 сутки от начала эксперимента у морских свинок (как зараженных, так и получивших плацебо) собирали носовые смывы (в 1,0 мл стерильного физиологического раствора) и по 1 мл крови для получения сыворотки. Материалы хранили при -20С до окончания эксперимента и использовали для оценки иммуногенности различными методами.
Обработка сывороток. Перед постановкой реакций гемагглютинации, микронейтрализации для удаления неспецифических ингибиторов вируса гриппа сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor-destroying enzyme производства Denka-Seiken, Tokyo, Japan) согласно протоколу производителя.
Неиммунные сыворотки морских свинок и лошадей, использовавшиеся для оценки ингибиторочувствительности вирусов гриппа, не подвергали обработке. В отдельно указанных случаях прогревали при температуре 56С в течение 30 минут, либо в течение 80С в течение 10 минут. Перед прогреванием сыворотки разводили в 10 раз стерильным физиологическим раствором.
Сыворотку морских свинок собирали у не иммунизированных животных-доноров. Лошадиную сыворотку использовали производства ООО «Биолот» (Санкт-Петербург). Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) использовалась для оценки уровня гуморального иммунного ответа в сыворотках крови, а также при определении чувствительности вирусов к неспецифическим ингибиторам гемагглютинации, содержащимся в сыворотках морских свинок. Реакцию РТГА проводили в соответствии с методическими указаниями по определению показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа [32]. Для детекции результатов реакции использовалась 1% взвесь эритроцитов курицы, человека (О (I) Rh группы) или морской свинки (в зависимости от задач конкретного опыта).
Реакция микронейтрализации использовалась для оценки уровней гуморального иммунного ответа в сыворотках крови морских свинок. Постановка реакции проводилась по протоколу, разработанному в ГУ НИИ Гриппа РАМН [56]. По описанной в протоколе схеме готовили рабочий раствор вируса гриппа, необходимый для проведения реакции. Перед постановкой реакции сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor-destroying enzyme производства Denka-Seiken, Tokyo, Japan) и добавляли питательной среды DMEM с L-глутамином, доводя разведение до 1:10. В круглодонных планшетах готовили последовательные двукратные разведения сыворотки (от 1/20 до 1/1280). Рабочее разведение вируса (концентрация вирусных частиц 100 ТСГГ)5о/50 мкл) на среде DMEM с L-глутамином с содержанием ТРСК-трипсина в концентрации 2 мкг/мл добавляли в равном объеме к сыворотке и инкубировали в течение 2 часов при 37С. Далее вносили данную смесь в подготовленные планшеты с монослоем клеток MDCK с добавлением 50 мкл питательной среды DMEM с L-глутамином и инкубировали в течение 48 часов при 37С в СОг-инкубаторе. В каждом планшете ставились контрольные пробы: контроль подбора дозы вируса, контроль состояния клеточной культуры, контроль сывороток. По окончании времени инкубации среду полностью удаляли, клетки фиксировали 80% холодным ацетоном и проводили ИФА. Для блокировки использовался раствор 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере. Постановка ИФА проводилась с применением пероксидазного коньюгата моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа А производства ФГБУ НИИ гриппа МЗРФ. В качестве субстрата использовался 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин (Sigma, США). Учет реакции проводился спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Расчет титра вируса производился по формулам, приведенным в руководстве по постановке реакции микронейтрализации [56].
Иммуноферментный анализ с использованием антител к IgG и IgA морских свинок использовался для определения содержания вирусспецифических антител указанных классов в сыворотках и назальных смывах животных. Очистка вирусов, использовавшихся в качестве антигенов, производилась центрифугированием в градиенте сахарозы. Вирусы наносили на планшеты в концентрации 16 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) в 50 мкл карбонат 57 бикарбонатного буфера в лунке (для детекции антител в сыворотках крови) или 32 ГАЕ в 100 мкл буфера в лунке для определения антител в назальных смывах.
Для блокировки использовался раствор 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере. Для детекции антител класса IgG использовали антитела козы к IgG морских свинок, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). Для определения антител класса IgA использовались овечьи антитела к IgA морских свинок, коньюгированные с пероксидазой хрена (Immunology Consultants Laboratory Inc., США). В качестве субстрата использовался 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин (Sigma, США).
Выделение РНК производили из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, вируссодержащей культуральной жидкости, суспензий клеток. Выделение осуществляли с помощью набора «РИБО-сорб» (АмплиСенс, Россия) или QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с инструкциями производителей наборов.
Получение кДНК осуществляли с помощью набора "Реверта-L" (Амплисенс, Россия) или QuantiTest Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с инструкциями производителей наборов. На данном этапе использовали универсальные праймеры, позволяющие в одной реакции синтезировать кДНК для разных фрагментов генома вирусов гриппа. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью метода микс-ПЦР [18]. Авторами метода разработаны пары праймеров, позволяющие в одной реакции определить происхождение гена от одного из родительских вирусов - эпидемического родителя или донора аттенуации. Праймеры, использованные при генотипировании реассортантных вирусов, представлены в табл. 1-3 приложения). Амплификацию проводили в ДНК-амплификаторе Eppendorf MasterCycler gradient с использованием программ, представленных в таблице 2. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле с добавлением этидиум бромида в концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты полимеразной цепной реакции визуализировали на трансиллюминаторе ЕСХ (Vilber Lourmat) при длине волны УФ 330 нм. Использовались реагенты производства «СибЭнзим» (Россия, Новосибирск).
Секвенирование последовательности сегментов генома осуществляли при использовании автоматического капиллярного секвенатора ЗІЗОх Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. Последующая обработка данных производилась с использованием пакета программ Lasergene 7.1 (DNAstar).
Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах
Из работ отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ», а также данных литературы было известно, что ряд реассортантных штаммов для инактивированной гриппозной вакцины обладает жесткой констелляцией генов, в результате чего их сложно использовать в качестве источника поверхностных антигенов при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, хотя такое направление работы представляется весьма перспективным при конструировании живых вакцин против пандемически опасных вирусов [124, 191, 295]. Поскольку в качестве источника антигенных детерминант для получения кодон-оптимизированных штаммов ЖГВ планировалось использовать реассортантные вирусы, несущие внутренние гены высокоурожайного штамма вируса гриппа PR8, была поставлена задача отработать методику скрещивания в РКЭ донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 с РЯ8-реассортантными вирусами, несущими гемагглютинин и неираминидазу от вирусов гриппа птиц H5N1 или от пандемического вируса H1N1.
Классическая методика подготовки штаммов отечественной живой гриппозной вакцины разработана Г.И. Александровой [1-2]. Реассортация эпидемических вирусов с аттенуированными вирусами - донорами аттенуации проводится в РКЭ. Получение вакцинного штамма включает в себя скрещивание при 32С родительских вирусов (донора аттенуации и эпидемического вируса, взятых в равных дозах), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25С температуре инкубации и клонирование реассортантов предельными разведениями.
Уже в 1950-х годах рядом исследователей было показано, что ключевым моментом, обеспечивающим успешность получения реассортантов в нужной формулой генома, является этап скрещивания [75, 89, 135, 154]. Так, описано повышение частоты получения рекомбинантных вирусов при использовании разных способов инактивации и при варьировании соотношения вирусных частиц разных штаммов [75, 89]. Положительные результаты были получены при изменении времени инкубации, разведении вируссодержащей жидкости и не одновременном внесении вирусов-родителей в куриный эмбрион [135, 154]. Был проведен анализ литературных данных и выбраны наиболее перспективные с нашей точки зрения подходы, позволяющие увеличить эффективность реассортации: облучение суспензии вируса ультрафиолетовым облучением (УФО), тепловая инактивация вируса перед скрещиванием, сокращение времени инкубации, изменение температуры инкубации, последовательное внесение вирусов-родителей в куриный эмбрион [135].
Для экспериментов по оптимизации метода реассортации были отобраны два вакцинных штамма инактивированной гриппозной вакцины против вирусов гриппа птиц H5N1: штамм VN1203 на основе вируса A/VietNam/1203/2004 и штамм NIBRG-23 на основе вируса A/turkey/Turkey/1/2005), а также вакцинный штамм ИГВ против пандемического гриппа H1N1 (A/California/07/2009-PR8).
Были апробированы различные модификации этапа скрещивания, теоретически способствующие реассортации, в том числе инактивация одного из вирусов [75, 135, 154]. В табл. 29 представлены 32 модификации, примененные нами в разных сериях экспериментов (опубликовано: [57]).
Использовалась инактивация «дикого» вируса, предварительно разведенного физиологическим раствором 1:10, с помощью повышенной температуры и в УФО. Длительная инактивация при температуре 40С не привела к желаемому результату (эксперимент № 2, табл. 29). В результате прогревания при 60С также не удалось добиться реассортации (эксперименты № 3 и 5, табл. 29). Наиболее эффективным способом воздействия оказалось УФО в течение 15-50 секунд. Оптимальное время облучения определялось индивидуально в каждом опыте и зависело от конкретных свойств вируса и его инфекционного титра.
Также были апробированы сокращение времени инкубации при скрещивании до 14, 18 часов, разное соотношение инфекционных титров родительских вирусов, последовательное внесение родительских вирусов в эмбрион и скрещивание в течение 6 суток при пониженной температуре.
Необычным оказалось то, что родительские вирусы, попадая в один и тот же развивающийся куриный эмбрион, не вступали в реассортацию не только при использовании классического, широко охарактеризованного метода [1-2, 336], когда эмбрион заражается смесью двух вирусов-родителей в равных пропорциях (эксперимент № 1, табл. 29). Они не скрещивались, даже будучи искусственно поставлены в условия, способствующие реассортации (частичная инактивация одного из вирусов, использование сочетания селектирующих факторов и пр.) (эксперименты № 1-9, 14-20, 22, 23, 25-32, табл. 29).
Добиться получения ограниченного числа реассортантов удалось подбором сложного комплекса условий, которые были разными для каждой пары вирусов. Как уже отмечалось выше, обязательным условием успешной реассортации оказалась инактивация «диких» родительских вирусов УФО. Наиболее легко при условии инактивации в реассортацию вступал вирус VN1203 (H5N1) (эксперименты № 10, 11, 13), при этом подавляющее большинство полученных реассортантов наследовало гемагглютинин птичьего происхождения, а остальные гены - от холодоадаптированного донора аттенуации (формула генома 7:1).
Вирус NIBRG-23 (H5N1) вступил в реассортацию только при сочетании следующего комплекса условий: УФО-инактивации, тщательного подбора соотношения инфекционных доз родительских вирусов и их последовательного внесения в куриный эмбрион (сначала УФО по инактивированный вирус H5N1, и через 4 часа - живой донор аттенуации), а также сокращения времени инкубации эмбрионов при 32С до 14-18 часов (эксперименты №21 и 24, табл. 29). При этом в группе № 21 было получено несколько 7:1 «двойных» реассортантов, а в группе № 24 - «тройной» реассортант, унаследовавший гемагглютинин птичьего происхождения, РА и М гены - от вируса PR8, а остальные гены - от донора А/Ленинград/134/17/57. Эксперименты № 9, 12, 14, 22 и 23 с другим соотношением количества вирусных частиц скрещиваемых штаммов, пролонгацией времени инкубации и одновременным внесением вирусов не привели к получению реассортантов (табл. 29).
Отдельно следует сказать об эксперименте с попыткой реассортации при пониженной температуре инкубации. Успешное использование такого варианта скрещивания описано в статье австралийской научной группы [336]. Авторам удалось получить холодоадаптированные вакцинные штаммы с антигенными детерминантами «дикого» вируса. Мы использовали, наряду с пониженной до 26С температурой инкубации, инфицирующие дозы «диких» вирусов, в 10 и 100 раз превышающие дозу донора аттенуации, для того, чтобы исключить возможность их подавления холодоадаптированных вирусов на самых ранних этапах репродукции при пониженной температуре (эксперименты № 7 и 8, табл. 29). Однако, в такой постановке опыта ни один из использованных вирусов в реассортацию с донором аттенуации не вступил.
A/California/07/2009-PR8 (H1N1) реассортантный вирус, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу от пандемического штамма A/California/07/2009 (H1N1), не вступил в реассортацию ни в одном из экспериментов, несмотря на то, что применялись самые разнообразные сочетания параметров скрещивания.
Таким образом, несмотря на многочисленные попытки, получить «тройные» реассортанты при скрещивании холодоадаптированного донора аттенуации с РЯ8-реассортантными вакцинными штаммами ИГВ удалось только в одном варианте скрещивания из 32-х использованных и только для одного из трех «диких» родительских вирусов, NIBRG-23. В подавляющем большинстве экспериментов родительские вирусы вообще не реассортировали между собой.
Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе
Анализ сочетания свойств температуро- и ингибиторочувствительности «диких» вирусов показал, что существует корреляция между признаками чувствительности вируса к повышенной температуре и его чувствительности к ингибиторам лошадиной сыворотки. Температуроустойчивые вирусы, чаще оказывались устойчивы и к ингибиторам нормальной сыворотки. Как уже упоминалось в обзоре литературы, в процессе циркуляции вирусов гриппа в человеческой популяции, судя по всему, идет постепенная адаптация к размножению при более низких температурах и накопление природных -вариантов [25]. Также есть исследование, подтверждающее, что в процессе антигенного дрейфа вирус постепенно подстраивается к рецептору хозяина [152]. Вероятно, свойства температуроустойчивости и ингибитороустойчивости являются связанными друг с другом из-за особенностей эпидемиологии штаммов гриппа. Новые варианты вирусов, являющиеся результатом реассортации сегментами генома между вирусами гриппа птиц и млекопитающих, часто наследуют от «птичьих» вирусов температуро- и ингибитороустойчивый фенотип. А поскольку именно такие вирусы являются антигенно шифтовыми вариантами, вакцинные штаммы на их основе могут быть более иммуногенны, чем вакцинные штаммы на основе дрейфовых вариантов, чувствительных к температуре и адаптированных к «человеческому» типу рецептора.
В научной литературе описана методика, позволяющая без внесения замен в аминокислотную последовательность белка, влиять на эффективность его экспрессии -изменение кодонного состава, или так называемая кодонная оптимизация/деоптимизация [158, 320]. Данный способ применяется для получения аттенуированных вирусов [90, 232], а также для повышения иммуногенности ДНК-вакцин [136, 171, 270, 353], поскольку аминокислотный состав, и, соответственно, структура белка, остаются неизменными.
В экспериментальных исследованиях, выполненных на ДНК-вакцинах для профилактики гриппа, оптимизации подвергали последовательность гемагглютинина. Опубликован ряд работ, посвященных влиянию кодонной оптимизации на иммуногенность ДНК-вакцин на основе гемагглютининов подтипов НІ [316], НЗ [331], Н5 [96, 171, 200]. Исследовались как показатели гуморального иммунного ответа, так и влияние оптимизации на клеточное звено иммунитета [316].
Повышение иммуногенности препарата с оптимизированным кодонным составом ожидается за счет увеличения экспрессии белка в клетках хозяина. Увеличение экспрессии после кодонной оптимизации подтверждается в ряду исследований, посвященных оптимизации последовательности ДНК-вакцин [316, 331]. В случае живого вируса, проводились исследования, посвященные аттенуации вируса и было показано снижение уровней репликации после деоптимизации кодонного состава [232]. В наших экспериментах последовательность гемагглютинина была изменена таким образом, чтобы оптимизировать экспрессию гемагглютинина в клетках млекопитающих. Уровни экспрессии оптимизированных вариантов гемагглютинина, как HI, так и Н5, превышали уровни экспрессии нативных белков. При этом инфекционные титры живых вирусов с измененным гемагглютинином были ниже, чем у не модифицированных вариантов, то есть для живого вируса оптимизация кодонного состава, направленная на увеличение экспрессии, приводила к снижению эффективности репродукции.
Тем не менее, несмотря на сниженный уровень репликации, вирусы с оптимизированным кодонным составом гемагглютинина вызывали у животных более интенсивный гуморальный иммунный ответ, чем варианты с не оптимизированным гемагглютинином. Превышение титров после иммунизации оптимизированными вариантами было сравнимо с данными, полученными после иммунизации ДНК-вакцинами. В среднем, разница в титрах по данным реакции торможения гемагглютинации, между оптимизированными и не оптимизированными вариантами, по данным исследований, выполненных на ДНК-вакцинах, составляла 3-4 раза [171, 316, 331].
Реассортанты с донором аттенуации на основе вирусов с модифицированным составом кодонов получить не удалось. Было известно, что возможны сложности при получении реассортантов на основе вирусов, содержащих внутренние гены от A/PR/8/34 [124, 191, 295]. Вероятно, существуют особенности констелляции генов подобных реассортантов, возможно, связанные с особенностями взаимодействия сегментов генома при упаковке в вирион [161, 245].
Как известно, ключевым моментом, определяющим эффективность реассортации, является этап скрещивания [75, 89, 135, 154]. Поэтому был проведен анализ данных о модификациях методики скрещивания, которые могут привести к увеличению числа реассортантных штаммов. Неоднократно упоминалось о эффективности такого приема как инактивация инфекционной активности вируса [75, 89]. Gotlieb и Hirst был опробован ряд модификаций методики скрещивания, позволявших существенно увеличить выход реассортантных штаммов по сравнению с классической методикой реассортации [135, 154]. Авторы использовали инактивацию одного из вирусов, вносили инактивированный вирус до живого, а также использовали разные соотношения количества вирусных частиц. По результатам исследования наиболее перспективным вариантом оказалось последовательное внесение вирусов в эмбрион, причем первым вносится инактивированный штамм, через 3-4 часа - живой штамм. Сокращение времени скрещивания до 14-18 часов также приводило авторов к положительному результату. Инактивация вируса в неразведенной хориоаллантоисной жидкости была малоэффективна, и при скрещивании инактивированного таким способом вируса частота получения рекомбинантов была низкой. Более успешной инактивация была при разведении вирусной суспензии в соотношении 1:10. Наибольший успех скрещивания наблюдался в случае, если исходный вирус был инактивирован до остаточного титра 1-2 lg. Исследование оптимального соотношения количества вносимых вирусов показало, что при внесении слишком больших и слишком малых количеств инактивированного вируса частота реактивации снижается. Для живого вируса как большие, так и малые количества давали одинаково положительный результат. В среднем, оптимальным соотношением для реассортации авторы указали 30 единиц активного вируса к 5000 инактивированного [135].
На основе анализа был выбран ряд модификаций методики скрещивания, часть из которых привела к положительному результату при скрещивании реассортантов на основе A/PR/8/34 с холодоадаптированным донором аттенуации. Тем не менее, реассортанты вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином получить не удалось. Возможно, это связано со сниженными показателями репликации оптимизированных штаммов, либо с еще более значительной констелляцией генов, чем у исходных вариантов вирусов.
