Введение к работе
Airrvii іікнпгі'к пи
Поты. В течение длительного времени разработка средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний носила эмпирический характер. Лишь последние достижения иммунологии позволили сформулировать общие принципы создания иммунобиологических препаратов. В частности, экспертами Комитета по биологической стандартизации ВОЗ рекомендовано проводить разработку средств вакцинопрофшіактики инфекций в тесной взаимосвязи с изучением иммушпатогенеза заболевания [Capron ct al., 1994]. Имея сведения об особенностях патогенеза изучаемой нозологии, можно вести прицельный поиск терапевтических агентов, влияющих на ключевые патологические звенья заболевания. В связи с этим доклинические испытания вакцин необходимо осуществлять на адекватной экспериментальной модели заболевания, имитирующей основные патофизиологические звенья заболевания у человека. Данный подход подразумевает установление общих закономерностей изменения неспецифических и специфических факторов иммунитета у иммунизированных животных не только в ходе вакцинального процесса, но и после заражения [Игнатьев, 2003]. Без этого нельзя решить принципиальный вопрос: исследуемый препарат неэффективен при данной инфекционной патологии или выбранная экспериментальная модель непригодна для тестирования иммунобиологических препаратов.
Экспериментальные и клинические исследования показывают, что в ответ на внедрение инфекционного агента организм отвечает универсальной, генетически запрограммированной реакцией, реализующейся в виде воспаления. Существуют сложные механизмы регуляции воспаления, но ведущая роль в поддержании гомеостаза отводится системе цитокинов [Черешпев и др., 2001]. Цптокпны - главные сигнальные молекулы иммунной системы, модулирующие активность ее клеток, определяющие активацию врожденного и формирование адаптивного иммунного ответа. В зависимости от превалирующей способности активировать или подавлять развитие воспалительной реакции цптокпны подразделяются на проиосналнтсльные и противовоспалительные. В последнее время появились убедительные данные о том, что клинический исход инфекции во многом зависит от баланса продукции про-/противовоепалнтельных медиаторов [Чсрешнев и др., 2001; Bidwell ct al., 1999; Dinarello, 2001; Feldmann e! al., 2004; Rice ct al., 2005]. Кроме того, при системной активации цитокины воздействуют на ткани и органы, не вовлечённые в инфекционный процесс, В этом случае медиаторы вместо защитной функции оказывают повреждающее действие, что наблюдается при генерализованных формах инфекционных заболеваний. Для генерализованных инфекций характерно развитие синдрома системного воспалительного ответа (SIRS - systemic inflammatory response syndrome), концепцию которого разработал R.C.Bone [Bone et al., 1992; Bone, 1996; Bone ct al., 1997]. SIRS - это манифестация определенных клпннко-лпбораторных критериев, свидетельствующих об активации цптокиповой сети и комплекса функционально связанных клеток (система фагоцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов). Следовательно, изучение реакции цптокиповой
системы играет важную роль для оценки адекватности используемой экспериментальной модели и исследования влияния испытываемых препаратов на течение генерализованных инфекций.
Данный подход мы применили для изучения иммунопатогенеза некоторых генерализованных бактериальных и вирусных инфекций, для которых ранее были разработаны эксперимен гальные модели на мышах линии BALB/c.
Среди возбудителей кишечных инфекций человека следует выделить энтерогеморрагическую E.coti 0157:Н7, которая вызывает развитие гемолитико-уремического синдрома (ГУС), являющегося ведущей причиной острой почечной недостаточности у детей [Karch ct al., 2005]. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что ГУС - системная патология, связанная с активацией цитокипового каскада [Ochoa et al., 2003]. Существующие средства терапии E.coli 0157:1-17 инфекции малоэффективны, поэтому разработка вакцин для профилактики заболевания остается актуальной задачей. В настоящий момент все исследованные вакцинные препараты оказались неэффективными, но в ходе испытаний стала ясна протективная роль мукозалыюго иммунитета [Li ct al., 2000; Lovett, 1998]. Поэтому в качестве кандидатной вакцины нами был предложен препарат ЕНЕС CIP 0157:Н7, полученный по технологии ghosts. Препарат представляет собой бактериальную стенку со всеми поверхностными антигенами в нативной форме, что возможно благодаря контролируемой экспрессии гена Е фага фХ174 в культуре бактерий [Lubitz et al., 1999; Szostak et al., 1996], и способен индуцировать мукозальиый иммунитет [Jalava et al., 2003].
Первоначально развитие SIRS ассоциировали с бактериальными инфекциями, но подобный феномен системной активации системы цитокшюв встречается и при ряде вирусных заболеваний. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, в т.ч. и лихорадке Денгс, вызываемой представителем сем. Flaviviridae - вирусом Денге (ВД). Заболевание является наиболее значимой арбовирусной инфекцией человека: только по официальным данным ежегодно регистрируется свыше 50 миллионов случаев лихорадки, и летальность при тяжелых формах заболевания достигает 20% [WHO, 2002]. Несмотря на громадную значимость лихорадки Деиге, до сих пор не создано средств специфической профилактики и лечения инфекции. Это диктует необходимость поиска патогенетических средств терапии заболевания.
Ведущим патогенетическим событием при развитии лихорадки Денге является усиление проницаемости сосудистого русла, обусловленного «цитокинопым штормом» и нарушением кадгеринового комплекса эндотелия [Schnittler et al., 2003]. Изменение структуры кадгеринового комплекса возникает в результате его взаимодействия с р-цепыо фибрина, включающего аминокислотные остатки с 15 по 42-ой (ВРімг) [Bach et al., 1998]. Показано, что синтетический олнгопептид В(3 IJ.42 (препарат FX-Об) при моделировании на животных острого нарушения коронарного кровообращения оказывал протективный эффект на сосуды [Pctzelbauer ct al., 2005]. Несколько позднее была установлена способность препарата ншибировать системную продукцию
провоспалительных цитокинов [Zacharowski et al., 2007]. Совокупность этих данных послужила основой для изучения влияния препарата FX-06 на течение экспериментальной ВД-инфекции.
Не менее значимым представителем сем. Flaviviridae является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который остается ведущей причиной нейроинфекций в Евразии [Burke et al., 2001; Gresikova et al., 1997]. Вирусный КЭ, в отличие от лихорадки Денге, протекает преимущественно с поражением центральной нервной системы, но при ряде летальных случаев, вызванных новыми субтипами вируса, отмечалось развитие геморрагического синдрома [Temovoi et al., 2003]. Подобно лихорадке Денге, при вирусном КЭ генерализация инфекции так же сопровождается системной гиперпродукцией ряда цитокинов, что подтверждено экспериментально [Игнатьев и др., 2003] и клиническими наблюдениями [Тимофеев и др., 2002; Atrasheuskaya et al., 2003]. В настоящее время наблюдается эволюция данной природно-очаговой инфекции: изменение клинической картины заболевания, случаи инфекции среди иммунизированных людей, что, вероятно, связано с проникновением в эндемичные регионы новых субтипов вируса и индивидуальными особенностями иммунного реагирования [Иерусалимский, 2001]. В связи с этим необходим тщательный анализ клинических и экспериментальных данных для решения практической задачи оценки прогноза развития и исхода инфекции КЭ, оценки протективности существующих вакцин. В частности, представляется целесообразным определение общих закономерностей развития иммунного ответа у вакцинированных животных после заражения.
В связи с этим целью работы являлось изучение иммунологических показателей при генерализованных инфекционных заболеваниях на моделях бактериальной (эитерогеморрагическая Escherichia colt 0157:117) и вирусных (вирус клещевого зіщефалита и вирус лихорадки Денге) инфекций, выявление общих факторов иммунопатогенеза и использование новых подходов для оценки профилактических и лечебных препаратов.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Выявление особенностей иммунного ответа у мышей линии BALB/c при экспериментальном моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции.
-
Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 0157:Н7 ghosts при парентеральной и мукозальной иммунизации мышей BALB/c по показателям неспецифического и специфического иммунитета.
-
Сравнительное изучение системной продукции цитокинов, динамики гуморального и клеточного иммунитета после заражения вирусом клещевого энцефалита интактных мышей BALB/c и мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.
-
Исследование динамики гематологических показателей и системной продукции цитокинов при моделировании у мышей BALB/c экспериментальной лихорадки Денге.
-
Оценка влияния синтетического фрагмента молекулы фибрина Щ\иг (препарат FX-06) на течение экспериментальной вирусной лихорадки Денге.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые продемонстрирована способность препарата ЕМЕС CIP 105282 ghosts индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ в эксперименте. Показано, что мукозальная иммунизация мышей данным препаратом обеспечивает формирование протективного иммунитета к заражению гетерологичным штаммом E.coli О157:117.
Впервые показано, что применение препарата FX-06 (синтетического деривата молекулы человеческого фибрина) оказывает терапевтический эффект при экспериментальном моделировании лихорадки Денге на мышах. Полученные данные могут лечь в основу для дальнейшей разработки патогенетических средств терапии вирусной лихорадки Денге у людей.
В результате проделанной работы при моделировании E.coli OI57:H7 инфекции и флавшшрусных инфекций была показана возможность динамического мониторинга системного уровня цитокинов для определения тяжести течения и прогнозирования исхода инфекционного процесса, оценки эффективности вакцин и терапевтических препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Цитокшювая реакция при моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции на мышах линии BALB/c соответствует системной продукции некоторых цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-10) при патологии, обусловленной E.coli 0157:Н7, у людей.
-
Препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts стимулирует специфический гуморальный, в том числе мукозальный, и клеточный иммунный ответ. Мукозальная иммунизация препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts превосходит по иммуногенным и протективным свойствам парентеральный способ иммунизации.
-
Динамика и концентрация сывороточных цитокинов у ннтактных мышей BALB/c и иммунизированных вакциной клещевого энцефалита после заражения вирусом клещевого энцефалита достоверно отличаются.
-
Динамика изменения гематологических показателей и реакция цитокнновой системы при заражении мышей BALB/c адаптированным штаммом вируса Денге 2-го серотипа соответствуют данным характеристикам при вирусной лігхорадке Денге у человека.
-
Показана возможность патогенетической терапии экспериментальной лихорадки Денге с помощью синтетического фрагмента молекулы фибрина врщз.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующігх международных конференциях: 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Nice, April 1-4, 2006); Молекулярная диагностика инфекционных болезней (Минск, 17-18 мая 2007 года). По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе три в реферируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела «Результаты и обсуждение»,
заключения, выводов и списка цитируемой литературы (26 источников на русском языке и 253 - на английском). Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 14 рисунков.
Список использованных сокращении: в/б - внутрибрюшинно, в/м - внутримышечно, ВД -вирус лихорадки Денге, ГУС - гемолитико-уремический синдром, ИЛ - интерлейшш, ИФА -иммуноферментный анализ, ИФН-у - интерферон-гамма, КЭ - клещевой энцефалит, ЛПС -липополисахариды, ОСО - отраслевой стандартный образец, ОТ-ПЦР - обратная транскрипция -полимеразная цепная реакция, РБТ - реакция блаеттрансформации, ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа, ЕНЕС - энтерогеморрагнческая E.coli, CARS - compensatory anti-inflammatory response syndrome (синдром компенсаторного противовоспалительного ответа), SIRS - systemic inflammatory response syndrome (синдром системного воспалительного ответа).
