Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время L-аспарагиновая кислота (L-Acn) находит широкое применение в пищевой, химической промышленности и медицине {Magnuson at al, 2007; Иежица и Спасов, 2007; Cash et al, 2010). Для химической промышленности L-Acn является перспективной "технологической платформой" для синтеза биодеградируемых полимеров и аминированных аналогов таких мировых химических "бестселлеров", как 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, используемых в производстве ПАВ, ингибиторов образования минеральных отложений в водных системах, ингибиторов коррозии, супер-абсорбирующих полимеров, усилителей роста растений, растворителей и пластмасс (Werpy and Petersen, 2004; Hasson at al, 2011).
Современное промышленное производство L-Acn основано на ферментативном аминировании фумаровой кислоты с использованием иммобилизованного фермента аспартазы или иммобилизованных бактериальных клеток с высокой аспартазной активностью. Кроме того, L-Acn получают из малеиновой кислоты в мембранной реакторной системе с использованием бактериальных клеток с высокими активностями малеат изомеразы и аспартазы (Yukawa et al, 2010). В обоих случаях, в качестве исходного сырья используются продукты переработки нефти (фумарат, малеат), что существенно ограничивает перспективы использования данной технологии в связи с растущими ценами на нефтепродукты. В этой связи микробиологический синтез L-Acn из возобновляемых и дешевых углеводов (по аналогии с известными примерами биотехнологического производства L-глутаминовой кислоты (L-Глу), L-лизина, и т. д.) мог бы стать перспективной альтернативой современному производству L-Acn из субстратов, получаемых из нефти.
Pantoea ananatis АЛ3355 - новый объект биотехнологии. Эта бактерия первого уровня био-безопасности, принадлежащая к роду Enterobacteriacea, обладает хорошими ростовыми характеристиками на простых средах с глюкозой или сахарозой. Она способна расти при умеренно низких значениях рН среды (от 4,5) в присутствии насыщающих концентраций L-Глу (Moriya et al, 1999) и устойчива к высоким концентрациям ряда других органических кислот. В настоящее время на основе штамма AJ13355 сконструирован продуцент L-Глу и внедрён в производство новый процесс ферментации, при котором культивирование клеток сопровождается кристаллизацией конечного продукта (Izui et al, 2003; Izui et al, 2006). P. ananatis AJ13355 можно рассматривать как перспективную био-платформу для производства различных метаболитов с низкой изоэлектрической точкой, таких как L-Глу, L-Acn и др. Поэтому исследование метаболизма данной бактерии и решение задач метаболической инженерии с целью создания штаммов-продуцентов на её основе является актуальной и практически значимой задачей.
Цель и задачи работы
Диссертационная работа посвящена изучению генетических факторов, влияющих на биосинтез L-Acn клетками P. ananatis и поиску альтернативных путей ассимиляции аммония для продукции аминокислот в штаммах энтеробактерий Escherichia coli и P. ananatis.
В ходе работы решались следующие задачи:
1. теоретически реконструировать и экспериментально подтвердить
функциональность путей биосинтеза и катаболизма L-Acn клетками P. ananatis;
2. выявить генетические факторы, необходимые для продукции L-Acn в
клетках і3, ananatis;
3. изучить возможность использования природного гена gdhA для
увеличения продукции L-Acn штаммом-продуцентом P. ananatis;
4. найти и биохимически охарактеризовать потенциальные
«биосинтетические» (аммонийфиксирующие) аспартатдегидрогеназы из
бактерий, принадлежащих к первому уровню биологической безопасности;
5. проверить возможность использования гетерологичной
аспартатдегидрогеназы в качестве дополнительного фермента,
обеспечивающего ассимиляцию аммония клетками Е. coli.
Научная новизна и практическая значимость работы
Проведена теоретическая реконструкция путей биосинтеза и катаболизма L-аспарагиновой кислоты клетками P. ananatis. Проведена экспериментальная проверка функционирования предсказанных путей в P. ananatis, выявлены генетические модификации, необходимые для продукции L-Acn, и осуществлено конструирование штамма, продуцирующего L-Acn.
В ходе работы обнаружено, что идентифицированная ОРС gdhA из P. ananatis кодирует НАДН-зависимую глутаматдегидрогеназу. Показано, что усиление экспрессии данной ОРС комплементирует отсутствие глутаматсинтазы. Впервые показаны преимущества использования НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы для продукции L-Acn.
В работе клонированы гены аспартатдегидрогеназ из бактерий Polaromonas sp., Rhodopseudomonas palustris и Bradyrhizobium japonicum; соответствующие ферменты очищены и биохимически охарактеризованы. Согласно полученным данным, ферменты из В. japonicum и R. palustris могут быть отнесены к анаболическим, участвующим в ассимиляции аммония. Введение аспартатдегидрогеназы из B.japonicum в штамм-продуцент L-аргинина на основе Е. coli привело к увеличению продукции в 2 раза.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 патента РФ. Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников НИИ Аджиномото-Генетика (Москва, 2008; Москва, 2010).
Апробация диссертации состоялась на совместном семинаре Научно-технического совета НИИ Аджиномото-Генетика и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 20 мая 2013 года.
Структура и объем работы
