Введение к работе
Актуальность проблемы. Bacillus thuringiensis (Bt) представляет собой широко распространенную в природе спорообразующую бактерию. Известны ее энтомопатогенные свойства, и промышленные препараты на основе (Bt) являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.
Основным действующим началом Bt, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является продуцируемые ею 5-эндотоксины (Cry и Cyt-белки). Они оказывают эффективное высокоспецифическое действие на различных насекомых, нематод, клещей -паразитов растений и животных и практически неактивны в отношении теплокровных организмов. Кроме инсектицидного действия 8-эндотоксины, вырабатываемые некоторыми подвидами Bt, проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов и фитопатогенным грибам.
Все это дает основание предположить, что Bt и её кристаллические 5-эндотоксины являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности ряда организмов, влияющих на экономическую деятельность человека. Создание и применение биоинсектицидов на основе 5-эндотоксинов позволяет обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, а также решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Встраивание генов этих белков в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми. В настоящее время так называемые ^/-растения занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных культур хлопка и кукурузы, которые выращивают на полях США.
В свою очередь, необходимость повышения эффективности действия указанных биоинсектицидов и уменьшения вероятности образования резистентных к ним форм насекомых делает необычайно актуальным детальное изучение механизма действия 5-эндотоксинов, в том числе взаимоотношения структуры и функции в их молекуле. Данное исследование посвящено решению этой проблемы на примере
3 /
эндотоксина Сгу9а, токсичного для гусениц пчелиной огнёвки (Galleria mellonella), являющейся паразитом пчелиных ульев.
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение функциональной роли спиралей N-концевого домена эндотоксина Сгу9а Bt. Для ее достижения бьши определены следующие задачи:
- получить эффективную систему для экспрессии рекомбинантного Сгу9А в клетках
бацилл, изучить и охарактеризовать свойства полученного белка, сопоставить их со
свойствами природного Сгу9А;
-создать генетическую систему для эффективного мутагенеза и получить серию точечных аминокислотных замен в белке Сгу9А в районе 5-й 6- а-спиралей, вьщелить полученные мутантные белки и изучить их биологическую активность на гусеницах G. mellonella;
- создать новые модели для тестирования антибактериального эффекта Сгу9А.
- изучить роль отдельных доменов молекулы Сгу9А и отдельных элементов их
структуры в антибактериальном и фунгицидном эффектах этого белка, сравнить
механизм действия Сгу9А на клетки насекомых и микроорганизмов.
Научная новизна. В работе впервые:
на примере рекомбинантного 6-эндотоксина Сгу9А показано, что Сгу-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими б-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно;
установлено что 5-эндотоксин Сгу9А, а так же его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью;
создана генетическая система отбора форм токсина с измененной эффективностью антибактериального эффекта;
при анализе полученных мутантов показано, что не только 5-я, но и 6-я а-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах G. mellonella;
- установлена корреляция между бактерицидной и инсектицидной активностями
мутантных форм Сгу9А.
Практическая ценность работы. Полученные данные о структурно-функциональных особенностях 5-эндотоксина Сгу9А создают базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного и антибактериального эффекта этого и других Cry-белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов с существенно повышенной эффективностью против гусениц пчелиной огнёвки с уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм этого насекомого.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на II Съезде по защите растений, (Санкт-Петербург, 2005), III Российском Симпозиуме «Белки и Пептиды», (Пущино, 2007), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008) и на двух международных конференциях.
Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 1 декабря 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на /І ^страницах машинописного текста и содержит c$J<^ рисунков и <Р таблиц. Список цитируемой литературы содержитД^источников, в том числе У^б-на русском языке.
