Введение к работе
Актуальность проблемы.
До недавнего времени общепринятым было представление о том, что эукариотические организмы имеют линейные хромосомы, а бактериальные геномы представляют собой кольцевые молекулы. Однако, в течение последних двадцати лет это правило перестало быть универсальным, поскольку линейные плазмиды и хромосомы были обнаружены в различных прокариотических организмах. Известны два структурно различных типа линейных бактериальных репликонов: имеющие ковалентно замкнутые «шпилечные» теломеры и содержащие белки, ковалентно присоединенные к 5' концам ДНК. Примерами репликонов второго типа являются линейные хромосомы и плазмиды бактерий рода Streptomyces. Линейными молекулами ДНК со шпилечными теломерами являются хромосомы и многие плазмиды спирохет рода Borrelia, одна из хромосом A. tumefaciens, а также линейные профаги N15, PY54 и фК02.
Ковалентно замкнутые теломеры являются одним из решений общей проблемы полной репликации концов линейных хромосом, связанной с неспособностью ДНК полимераз инициировать синтез ДНК de novo. У большинства эукариот эту операцию выполняет специальный фермент, теломеразу, альтернативные механизмы реализуются посредством специализированных белков, ковалентно присоединенных к 5' концам или рекомбинации. Молекулярные механизмы многих этих процессов достаточно хорошо изучены. Однако, сведения о механизмах репликации и стабильного наследования линейных прокариотических репликонов, весьма ограничены. Основное внимание в настоящей работе посвящено изучению этих проблем.
Цель и задачи исследования.
Умеренный бактериофаг N15 в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Е. coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми теломерами (V.Ravin and Shulga, 1970; Рыбчин и Сварчевский, 1984). Тот факт, что хозяином фага N15 является Е. coli, - классический объект, для работы с которым создано большинство известных методов молекулярной генетики и генетической инженерии прокариот, позволяет использовать фаг N15, как удобную экспериментальную модель для изучения всех прокариотических «шпилечных» репликонов.
Основная цель работы состояла в изучении особенностей молекулярной генетики, в том числе механизма репликации ДНК N15, анализе того, как обычные механизмы репликации и стабильного наследования бактериальных репликонов адаптируются к линейной конформации ДНК, исследованию механизмов эволюции линейных фагов-плазмид и происхождения линейной ДНК у прокариот.
При этом были поставлены следующие осіїОВНШлкішян^д-1. Определение полной структуры генома!бактещ](Щ^||Ц|}д
Исследование механизмов установления и поддержания лизогенного состояния.
Идентификация и анализ механизмов стабильного наследования плазмидного профага."
Идентификация и характеристика фермента, обеспечивающего образование ковалентно замкнутых теломер.
Идентификация и характеристика генов и сайтов, обеспечивающих репликацию ДНК N15.
Создание модели репликации ДНК линейной плазмиды N15.
Научная новизна работы.
Важнейшим результатом работы является первая экспериментально доказанная модель репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами для прокариот.
Впервые определена полная структура генома бактериофага, в лизогенном состоянии представляющего собой линейную плазмиду. В результате был идентифицирован набор функций, необходимых для поддержания линейных плазмид и для фагового пути развития.
Установлено, что стабильное наследование плазмидного профага N15 обеспечивается за счет правильного распределения реплицированных молекул между дочерними клетками при делении (аналогично тому, как это происходит в процессе митоза у эукариот), идентифицированы гены, ответственные за выполнение этих функций и центромерные сайты. Идентифицированы функциональные домены соответствующих белков. Установлено, что стабильное наследование линейных плазмид, в отличие от кольцевых, требует наличия множественных центромерных сайтов, распределенных в различных районах их геномов.
Исследованы механизмы установления и поддержания лизогенного состояния, идентифицирован ген антирепрессора фага N15 и показано, что его экспрессия контролируется за счет преждевременной терминации транскрипции, вызываемой короткой регуляторной РНК (СА РНК), являющейся продуктом процессинга лидерной части транскрипта. Показано, что этот механизм регуляции экспрессии генов обеспечивает кратковременный синтез продукта в ответ на внешний сигнал, независимо оттого, продолжает ли действовать этот сигнал или нет. Гены, кодирующие СА-подобные регуляторные РНК, обнаружены в геномах различных бактерий, фагов и плазмид, как линейных, так и кольцевых.
Идентифицирован и исследован in vivo фаговый фермент, протеломераза, обеспечивающий образование ковалентно замкнутых теломер в ходе репликации линейного плазмидного профага. Показано, что в ходе репликации плазмиды протеломераза разрезает дуплицированные теломеры, образуя шпилечные концы реплицированных молекул. Показано, что аналогичную функцию выполняет продукт гена telK линейного фага-плазмиды фК02, обнаружен гомолог протеломеразы в геноме A. tumefaciens (ген AGRC4584). Показано, что протеломераза и сайт ее действия являются независимым
функциональным модулем, способным преобразовывать кольцевые репликоны в линейные.
Идентифицированы и охарактеризованы гены N15, необходимые для репликации его ДНК. Установлено, что единственный ген, херА, обеспечивает репликацию кольцевой миниплазмиды, в то время как репликация линейной плазмиды требует дополнительно ген протеломеразы. Показано, что огі сайт расположен несимметрично относительно центра плазмиды, в пределах гена херА, а инициируемая с него репликация является двунаправленной.
На основе представленных выше результатов сделан вывод, что репликация профага N15 следует следующей модели. Двунаправленная репликация инициируется с огі сайта, расположенного асимметрично относительно центра молекулы, в пределах гена герА. После дупликации левой теломеры протеломераза разрезает эту последовательность, что приводит к образованию Y- образной молекулы. Репликация правой теломеры и ее процессинг протеломеразой, приводящий к образованию двух дочерних линейных молекул, завершают репликацию плазмиды.
Выдвинута гипотеза о том, что эта модель репликации применима не только для профага N15, но и для других прокариотических репликонов с ковалентно замкнутыми теломерами, а именно, линейных хромосом и плазмид Borrelia burgdorferi, линейной хромосомы A. tumefaciens, и линейных фагов-плазмид PY54 и фК02. В то же время это принципиально новая модель репликации ДНК, поскольку она отличается от ранее предложенных моделей репликации ДНК эукариотических организмов и их вирусов, имеющих ковалентно замкнутые теломеры, в частности, поксвирусов. Это свидетельствует скорее в пользу гипотезы об эволюционно независимом возникновении прокариотических репликонов с ковалентно замкнутыми концами, чем в пользу ранее принятого мнения о переносе генов протеломераз от эукариот (поксвирусы) к прокариотам (Borrelia).
Практическая ценность работы.
Помимо исследования новых аспектов фундаментальной проблемы репликации и сохранения генетического материала, полученные результаты могут способствовать разработке новых средств борьбы с патогенными спирохетами Borrelia, возбудителями болезни Лайма, основанных на создании высокоспецифических ингибиторов, имеющих своей мишенью процессы репликации, образования шпилечных теломер и сегрегационной стабильности.
В результате выполнения данной работы на основе репликона фага N15 созданы линейные клонирующие векторы и показаны их преимущества (связанные с отсутствием сверхспирализации) по сравнению с обычными кольцевыми векторами при клонировании фрагментов ДНК, содержащих инвертированные повторы, - структуры, которые часто встречаются в ДНК эукариот (Равин и Равин, 1994, 1998; Ravin and Ravin, 1999). Таким образом, представляется перспективным использование этих векторов для клонирования последовательностей ДНК, нестабильных в обычных векторах.
Апробация работы.
Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: школе молодых ученых «Молекулярная биология и биоинженерия: новое поколение» (Черноголовка, 1997), ), The 6 International workshop on P2, P4 and related bacteriophages (Berlin, Germany, 1998), конференции «Геном человека-98» (Москва, 1998), Международном Симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001), The 7 International workshop on P2, P4 and related bacteriophages (Sigtuna, Sweden, 2001), The Xllth International Congress ofVirology (Paris, France, 2002).
Структура и объем работы.
