Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 6
1. Репликация кольцевых бактериальных плазмид 6
1.1 Сайты инициации репликации 7
1.2 Репликационный аппарат E.coli 11
1.3 Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных Rep белков ... 13
1.4 Репликация фага-плазмиды Р4 15
1.5 Репликация по механихму вытеснения цепи (Strand Displacement Replication)... 17
1.6 Репликация по механизму катящегося кольца 19
2. Регуляция репликации и числа копий плазмид 21
2.1 Контроль с помощью антисмысловой РНК 22
2.2 Контроль числа копий с помощью репрессора транскрипции и антисмысловой РНК 27
2.3 Регуляция с помощью итеронов 29
3. Векторы для экспрессии белков в клетках Е. coli 32
3.1 Регулируемые промоторы 33
3.2 Плазмидный репликон 35
4. Особенности генетики и механизма репликации ДНК бактериофага N15 36
Материалы и методы 43
Результаты 48
1. Механизмы регуляции числа копий профага N15 48
1.1 Идентификация промотора гена герА и изучение влияния СВ репрессора на
уровень транскрипции герА 48
1.2. Анализ роли антирепрессоров N15 в регуляции числа копий и уровня
транскрипции герА 50
1.3 Анализ взаимодействия репрессор-антирепрессор в бактериальной двугибридной
системе 51
2. Функциональная характеристика репликационного rem герА 53
2.1 Анализ аминокислотной последовательности RepA белка 53
2.2 Репликация миниплазмид, основанных на репликоне N15, в штаммах Е. coli, содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации 55
2.3 Литическое развитие фага N15 в штаммах содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации 60
2.4 Зависимость репликации фага N15 от DnaG клетки-хозяина 62
2.5 Репликация N15 не зависит от хеликазы Rep Е. coli 63
2.6 Функциональная роль потенциального DnaA-бокса в ori сайте N15 63
3. Экспрессионные вектора на основе репликона фага N15 65
3.1 Конструирование серии экспрессионных pN15E векторов 66
3.2 Конструирование штамма Е. coli DH31soplacI 68
3.3 Регуляция числа копий pN15E векторов 70
3.4 Стабильное наследование pN15E векторов в штамме DU31soplacI 71
3.5 Диапазон регуляции синтеза продукта в экспрессионных системах pN15E 72
3.6 Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы рестрикции Ecll8Ki 74
Обсуждение 76
1. Регуляция репликации и конроль числа копий профага N15 76
2. Функциональная характеристика герА 78
3. Роль инициаторного белка DnaA Е. соїі в регуляции репликации N15 83
4. Векторы для экспресии белков в клетках Е. соН на основе репликона N15 84
Выводы 88
Список публикаций по теме диссертации 89
Цитированная литература 90
- Репликация кольцевых бактериальных плазмид
- Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных Rep белков
- Механизмы регуляции числа копий профага N15
- Регуляция репликации и конроль числа копий профага N15
Введение к работе
До недавнего времени общепринятым было представление о том, что эукариотические организмы имеют линейные хромосомы, а бактериальные геномы представляют собой кольцевые молекулы. Однако, в течение последних двадцати лет это правило перестало быть универсальным, поскольку линейные плазмиды и хромосомы были обнаружены в различных прокариотических организмах. Первым обнаруженным линейным репликоном у прокариот является умеренный бактериофаг N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Е. coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми теломерами. Позднее было установлено, что аналогичную структуру ДНК имеют линейные хромосомы и плазмиды спирохет рода Borrelia (Barbour and Garon, 1987; Fraser et ah, 1997), одна из хромосом Agrobacterium tumefaciens (Allardet-Servent et ah, 1993; Goodner et ah, 1999), а также профаги умеренных бактериофагов PY54 (Hertwig et al., 2003) и фК02 (Casjens et al., 2003).
В то же время, информация о молекулярных механизмах репликации линейных хромосом с ковалентно замкнутыми теломерами у прокариот весьма ограничены. В частности, до проведения этой работы практически отсутствовали данные о свойствах репликационных белков линейных плазмид и механизмах регуляции их репликации и числа копий, необходимые для разработки моделей репликации. Основное внимание в настоящей работе посвящено изучению этих проблем на примере умеренного бактериофага N15. Тот факт, что N15 является не просто плазмидой, а умеренным бактериофагом, позволяет предположить, что репликация его ДНК может следовать разным механизмам в плазмидном состоянии и при литическом развитии, с участием различных репликационных белков.
Одним из практических применений фундаментальных знаний в области репликации плазмид и контроля экспрессии их генов является конструирование векторов для продукции целевых белков. Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов, используемых для продукции гетерологичных белков, вследствие того, что она способна к быстрому росту до высоких концентраций на простых средах, ее генетика достаточно хорошо охарактеризована, доступен большой набор клонирующих и экспрессионных векторов и мутантных штаммов.
Идеальный экспрессионный вектор должен обеспечивать высокий уровень синтеза продукта в случае индукции при минимально низком базовом уровне экспрессии, что необходимо, в первую очередь, при экспрессии продуктов, которые могут быть токсичны для клетки. Несмотря на это, большинство современных систем для синтеза гетерологичных белков в Е. coli обладают относительно узким диапазоном регулирования. Вследствие чего системы, обладающие низким базовым уровнем экспрессии, не позволяют достичь высокого уровня синтеза продукта при полной индукции, а системы с высоким максимальным уровнем имеют обычно и высокий базовый уровень экспрессии, что делает их мало пригодными для получения чужеродных белков, которые могут быть токсичными для бактериальной клетки. Таким образом, задача создания экспрессионных систем, сочетающих высокий максимальный уровень экспрессии продукта с большим диапазоном регуляции (т.е. низким базовым уровнем), продолжает оставаться актуальной.
Основная идея нашего подхода состоит в использовании регулируемого промотора в сочетании с плазмидным репликоном, число копий которого может регулироваться в широком диапазоне, от 3-4 до 100 на хромосому. Диапазон регуляции синтеза продукта раширяется за счет перемножения эффектов активации промотора и эффекта дозы гена. Для создания этих систем экспресии были использованы репликон и регуляторные элементы бактериофага N15.
Репликация кольцевых бактериальных плазмид
Плазмиды являются автономно реплицирующимися экстрахромосомными элементами. Они были обнаружены в организмах, представляющих все три класса живых существ: Archaea, Bacteria, и Eukarya (Woese et. al. 1990). Плазмиды могут содержать существенную долю общей генетической информации организма, которая достигает 25% у некоторых представителей Archaea (Holmes et. al., 1995; Zillig, et., al., 1994). Плазмиды могут включать и переносить гены за счет рекомбинации или транспозиции, таким образом, способствуют генетическому обмену в бактериальных популяциях.
Характерной чертой плазмид является то, что их репликация является автономной и контролируемой. Известны три принципиальных механизма репликации кольцевых плазмид, а именно: тета-механизм, вытеснение цепи и механизм катящегося колеса (RC). История исследований репликации плазмид привела к идеи о том, что тета-репликация чаще встречается в грам-отрицательных бактериях, в то время как RC-репликоны более характерны для грам-положительных бактерий. Впоследствии, эта точка зрения не подтвердилась, но, тем не менее, большая часть информации о механизмах тета-репликации получена в результате изучения репликонов грам-отрицательных бактерий, в то время как информация о RC-плазмидах основана на данных, полученных для грам-положительных микробов. Механизм вытеснения цепи характерен для плазмид IncQ семейства. В данном обзоре в первую очередь будет расмотрен тета-механизм репликации, поскольку именно по этому механизму происходит репликация профага N15 (Ravin et al., 2003; Mardanov and Ravin, 2006).
Как правило, плазмиды содержат так называемый «существенный район», необходимый для их репликации и контроля числа копий, а также гены, которые могут рассматриваться как «несущественные» (для поддержания плазмиды), - кодирующие функции конъюгативного переноса, устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, и др. «Существенный» район плазмид содержит три функциональных элемента: (1) сайт инициации репликации (orі), (2) ген(ы), кодирующие белок(и), участвующие в инициации репликации (обычно называемый Rep), хотя известны плазмиды, их не имеющие, (3) плазмидные гены, контролирующие репликацию и число копий. В случае, если плазмида кодирует Rep белок, то ее оп -сайт содержит специфические сайты его связывания.
Тета-механизм репликации предполагает первоначальное расплетение цепей ДНК, синтез РНК-праймера (pRNA) и инициацию синтеза ДНК путем его расширения (Kornberg and Baker, 1992). Синтез ДНК является непрерывным по одной цепи (ведущей) и прерывающимся по отстающей цепи, хотя синтез обеих цепей происходит координировано (обзоры Kelman and O Donnell, 1995 и Zavitz and Marians, 1991). Репликация может инициироваться с одного или нескольких оп -сайтов и быть одно-или двунаправленной. Интермедиаты, образующиеся в процессе репликации, имеют вид греческой буквы 9, что и дало название этому механизму репликации. Практически все плазмиды, использующие тета-механизм репликации, кодируют собственные Rep белки. Некоторые репликоны могут зависить от бактериальной ДНК-полимеразы I (DNA Poll), необходимой на ранних стадиях инициации синтеза ведущей цепи.
Большинство плазмид, реплицирующихся по тета-механизму, кодируют собственные Rep белки и, соответсвенно, содержат сайты его связывания в пределах оп -района. Другими характерными чертами ог/-сайтов (см. рис.1) является (1) наличие АТ-богатого района, в котором происходит первоначальное расплетение нитей и сборка репликационного комплекса, и (2) один или несколько сайтов связывания бактериального инициаторного белка DnaA (dnaA-сайты) (Bramhill and Kornberg, 1988, Kornberg and Baker, 1992). Множественные сайты Dam метилирования (GATC) присутствуют в сайте инициации репликации хромосомы E.coli, oriC, а также многих плазмид, например PI (Brendler et al., 199lab) и pSClOl (Bramhill and Kornberg 1988). Сайты инициации репликации могту также содержать сайты связывания бактериальных структурных регуляторных белков IHF (integration host factor) и/или FIS (factor for inversion stimulation). Эти факторы обеспечивают пространственную близость различных компонентов оп -сайта или нескольких огі-сайтов одной плазмиды (напр. R6K). Эти сайты являются существенными компонентами сайта инициации репликации, поскольку они необходимы для правильной сборки репликационного комплекса (Dellis and Filutowicz 1991, Dellis et al., 1992, Stenzel et al., 1991). Сайты связывания структурных белков также присутствуют в oriC сайте E.coli (Woelker and Messer 1993).
Структура огі-сайта и инициация репликации Е. coli
Размер минимального фрагмента, обеспечивающего автономную репликацию хромосомы, составляет 258 нуклеотидов. Этот район содержит сайты связывания инициаторного белка DnaA (DnaA-сайты), АТ-богатую область, содержащую три последовательности длиной в 13 нуклеотидов, включающие сайт Dam - метилирования GATC (Рис. 2). OriC содержит сайты связывания белков IHF и FIS. Оба белка, по-видимому, помогают инициатору DnaA раскручивать ДНК.
Сборка инициаторного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-сайтами, что приводит к образованию компактной эллиптической структуры, содержащей 20 мономеров DnaA, вокруг которой «обернута» ДНК oriC. На следующем этапе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, что приводит к образованию «открытого комплекса». При 37 С и выше DnaA может обеспечивать расплетение ДНК самостоятельно, при более низких температурах требуется участие белков HU или IHF. На следующем этапе в состав открытого комплекса включается ДНК-хеликаза DnaB. Этот белок взаимодействует с однонитевым расплетенным участком и входит в состав препраимирующего комплекса 1 в виде гексамера, образовавших комплекс с шестью белками DnaC, каждый из которых связывает молекулу АТР. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза АТР, следствием чего является активация DnaB. В результате образуется препраймирующий комплекс 2.
Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных Rep белков
Инициация репликации требует сборки репликационного комплекса в составе холофермента ДНК-полимеразы Ш, DnaB хеликазы и DnaG праймазы в сайте инициации репликации. Большинство плазмид, реплицирующихся по тета-механизму, требуют кодируемого плазмидой Rep белка и бактериального белка DnaA для инициации репликации. Плазмидный оп-сайт обычно включает не только сайты связывания этих белков, но также и AT- богатый район, содержащий прямые повторы, аналогичные 13 -нуклеотидным элементам в oriC. Этот район обеспечивает локальное расплавление ДНК. Связывание Rep белка с соответствующими последовательностями в ori- сайте приводит к образованию первоначального комплекса, аналогичного образуемому под действием DnaA в oriC. Комплекс Rep-ДНК в сочетании с DnaA обеспечивает перенос DnaB-DnaC комплекса в ori и расплетание АТ-богатого участка.
Структурная организация инициаторного комплекса может происходить более эффективно в присутствии бактериальных факторов HU, IHF и FIS. Процесс сборки инициаторного комплекса был исследован для нескольких плазмид.
Плазмида pSCl 01
RepA, инициаторный белок плазмиды pSClOl, присутствует в клетке в виде мономеров или димеров, соотношение которых определяет эффективность репликации (Ingmer et al., 1995). И мономеры и димеры обладают функциональной активностью, но играют различные роли: в то время как мономеры связываются с итеронами в оп -сайте, инициируя репликацию, димеры связываются с соседним сайтом, представляющим собой инвертированный повтор, тем самым репрессируя транскрипцию гена герА (Manen et al., 1992). Помимо RepA, инициация репликации pSClOl требует DnaA и IHF (Hasunuma and Sekiguchi, 1977, Gamas et al., 1986, Stenzel et al., 1987). Связывание IHF вызывает изгиб ДНК (Stenzel et al., 1987), облегчающий взаимодействие между отдельными молекулами DnaA, связанными с DnaA-сайтами (Stenzel et al., 1991). Связывание RepA с «/"/-районами стабилизирует эти контакты (Stenzel et al., 1991).
Плазмида RK2
Кодируемый плазмидой инициаторный белок TrfA (Konieczny et al., 1997) связывается с пятью 17-нуклеотидными итеронами. Это взаимодействие вызывает локальное расплавление ДНК в районе АТ-богатого участка. Связывание DnaA с четырьмя сайтами, присутствующими в этом районе, также требуется для инициации репликации. DnaA и TrfA необходимы также для связывания DnaB с оп -сайтом.
Плазмида R1
Репликация плазмиды Rl in vivo и in vitro зависит от инициаторного белка, RepA (Diaz et al., 1981 KoHe et al., 1978, Masai and Arai et al., 1987, Uhlin and Nordstrom 1978). В отличие от описанных выше случаев oriR не содержит итеронов. RepA, вероятно, в форме димера, связывается с двумя палиндромными последовательностям (Giraldo and Diaz, 1992). После образования первичного комплекса RepA-oriR, дополнительные молекулы RepA связываются с участком между этими палиндромами, что приводит к расплавлению АТ-богатого участка (Masai and Arai, 1988). Репликация ДНК Rl in vitro требует участия DnaA (Masai and Arai, 1987, Ortega-Jimenez et al., 1992), однако DnaA не является необходимым in vivo (Bernander et al., 1991, Tang et al., 1989). Репликация in vivo в отсутсвии DnaA является низкоэффективной, однако, мутанты с повышенным уровнем экспрессии герА реплицируются более эффективно (Bernander et al., 1991). Эти результаты свидетельствуют о важной роли RepA в активации оп -сайта и позволяют предположить, что RepA обеспечивает локальное расплавление ДНК и связывание DnaB-DnaC комплекса.
Бактериофаг Р4 в лизогенном состоянии либо интегрируется в хромосому Е. coli, либо поддерживается в виде автономно реплицирующейся кольцевой плазмиды. Репликационный белок альфа фага-плазмиды Р4 обеспечивает двунаправленную тета-репликацию его ДНК, инициируемую на сайте oril (Krevolin et al., 1985). Другой сайт, err, расположенный на расстоянии примерно 4500 нт от oril, необходим in cis для репликации ДНК Р4 (Flensburg and Calendar, 1987; Tocchetti et al., 1999). Репликация зависит как от фагового гена альфа-белка, так и от бактериальных генов. Для элонгации необходимы бактериальные белки SSB и ДНК-полимераза III, в то время как инициаторный белок DnaA, а также хеликаза DnaB, белок DnaC, праймаза DnaG, а также вспомогательная хеликаза Rep Е. coli не требуются (Lindqvist and Six, 1971; Barrett et al.,1972; Bowden et al., 1975; Diaz Orejas et al., 1994). Все эти функции обеспечиваются продуктом фагового гена a (Flensburg and Calendar, 1987; Ziegelin et al., 1993). Альфа-белок, длиной 777 аминокислот, содержит несколько функциональных доменов: (1) N-концевой домен обладает праймазной активностью. Этот район содержит консервативный мотив EGYATA, характерный для многих праймаз конъюгативных плазмид (Strack, et al.,1992; Ziegelin, et al., 1993). Будучи изолированным, этот домен сохраняет праймазную активность и может комплементировать мутацию в праймазном домене альфа-белка (Ziegelin et al., 1995). (2) Середина и С-концевой район альфа-белка ответственны за хеликазную активность и содержат мотив, характерный для связывания нуклеотидов типа A (Strack et al., 1992; Ziegelin et al., 1995). (3) С- концевой фрагмент альфа- белка обладает ДНК-связывающей активностью (Ziegelin et al., 1995). Белок связывается с декамерными последовательностями, присутствующими в oril и err сайтах.
Механизмы регуляции числа копий профага N15
Наряду с СВ репрессором ранее были идентифицированы два белка фага N15, являющихся «антирепрессорами», - продукты генов 31 (AntA, Ravin et al., 1999) и 471 (gp471, неопубликованные данные). Понятие «антирепрессор» подразумевает в этих случаях фаговые белки, экспрессия которых нарушает установление и поддержание лизогенного состояния; механизмы их действия установлены не были.
Целью этой части работы было определить, влияет ли экспрессия антирепрессорных белков на число копий миниплазмид, основанных на репликоне N15. С этой целью в штаммы Е. coli, содержащий низкокопийную кольцевую плазмиду pNCIO, дополнительно вводили векторы-продуценты антирепресорных белков. В обоих случаях гены антирепрессоров были клонированы в экспрессионном векторе pBAD24 под контролем индуцируемого арабинозой araPgAD промотора, - плазмиды pBAD-31(pCAI2) и pBAD471. Штаммы DH10B/pNC10+pCA12 и DH10B/pNC10+pBAD 471 выращивали до середины логарифмической фазы роста, а затем вносили в среду арабинозу до концентрации 0.1%, что обеспечивало полную индукцию агаРвлй промотора и синтез антирепрессора. Препараты плазмидной ДНК выделяли в различные моменты времени после индукции и анализировали с помощью гель электрофореза. Полученные результаты (рис. 12) показывают, что экспрессия обоих 1, - маркер мол. массы (ДНК фага лямбда, обработанная Hindlll) 2, 3,4 - препараты плазмидной ДНК, выделенные из штамма DH10B/pNC10+pCA12 через 0, 60, 180 мин (соответственно) после индукции синтеза антирепрессора. 5, 6, 7 - то же, но для штамма DH10B/pNC10+pBAD-471 антирепрессоров приводит к увеличению числа копий pNCIO в 20-50 раз.
Поскольку число копий pNCIO определяется уровнем экспрессии г ер А, антирепрессор может либо непосредственно активировать его транскрипцию (будучи транскрипционным фактором) или нарушать репрессию траснкрипции г ер А, обусловленную СВ репрессором. Для проверки этих предположений мы исследовали влияние антирепрессоров на активность Ргерл и уровень его репрессии посредством СВ. Для этого в траснскрипционные репортерные штаммы, описанные в п.5.1, дополнительно вводили плазмиды-продуценты антирепрессоров и определяли активность р-галактозидазы, в зависимости от экспрессии AntA или gp471. В результате было установлено (табл. 4), что антирепрессоры не влияют на активность Ргерл, но заметно снижают уровень его репрессии СВ репрессором.
Представленные выше результаты предполагают, что антирепрессоры AntA и gp471 препятствуют связыванию СВ репрессора с операторными сайтами, что приводит к активации литического равзвития в целом и, в частности, к активации репликации N15 и увеличению числа копий. Наиболее вероятным механизмом является прямое связывание антирепрессора с репрессором, делающее его нефункциональным. Для проверки этого предположения мы протестировали возможность такого взаимодействия в двугибридной системе в Е. coli.
Эта система основана на способности гетеродимера белка LexA, содержащего один ДНК-связывающий домен дикого типа Lex+ и один мутантный (LexA408) домен, репрессировать транскрипцию с промотора (PsfiA), контролируемого соответствующим гибридным оператором (ор408/ор+). Гомодимеры не связываются с ДНК настолько прочно, чтобы обеспечить репрессию. После замещения доменов димеризации белков LexA+ и LexA408 исследуемыми пептидами, гибридные белки синтезируются совместно, и их способность взаимодействовать оценивается по наблюдаемому уменьшению экспрессии химерного репортерного гена sfiAr.lacZ, регулируемого гибридным оператором (Dmitrova et al., 1998).
Копродукция гибридных пептидов, состоящих из доменов LexA-DBD и LexA408-DBD, соединённых с gp471 и СВ, соответственно, привела к значительной (в 10 раз) репрессии промотора Psfi. По отдельности гибридные пептиды вызывали существенно более слабую репрессию репортерного промотора - в 1,6 раза в случае LexA408:CB и лишь в 1,2 раза в случае LexA+ : gp471. Эти данные свидетельствуют о том, что репрессор СВ и антирепрессор gp471 могут взаимодействовать in vivo.
Результаты, полученные в случае AntA антирепрессора, не позволяют однозначно сделать вывод о его взаимодействии с СВ, поскольку коэкспрессия LexA408:CB и LexA :AntA приводила к более низкому уровню репрессии промотора Psfi - всего в 2.2 раза. Такая репрессия может объясняться как взаимодействием СВ - AntA, так и быть результатом репрессии промотора каждым пептидом по отдельности (репрессия в 1,6 раза в случае LexA408:CB и в 1,7 раза в случае LexA+:AntA).
Ранее было установлено, что минимальный репликон фага N15, обеспечивающий репликацию кольцевой миниплазмиды, включает только один ген герА. Репликация линейной плазмиды дополнительно требует наличие теломерных последовательностей и гена протеломеразы.
Было установлено (Ravin et al., 2003), что сайт инициации репликации фага N15, or/, расположен в концевой части герА гена. Он содержит три копии последовательности GATCCA, А/Т богатый участок длиной 22 нт (18.2% G+C) между двумя из этих повторов и последовательность ТТТТССАСС, на один нуклеотид отличающуюся от консенсусной последовательности сайта связывания инициаторного белка E.coli., DnaA. Присутствие потенциального сайта связывания DnaA позволяет предположить, что этот белок принимает участие в инициации репликации N15.
Важную роль г ер А для репликации ДНК N15 дополнительно подтверждается тем, что все известные в настоящее время мутации, приводящие к нарушению репликации, были картированы в гене г ер А. Также было показано, что репликация N15 не зависит от polА, гесА, (Сварчевский и Рыбчин, 1984) и генов теплового шока dnaJ, dnaK и grpE, существенных, например, для репликации ДНК фага лямбда.
В этой части работы мы исследовали функциональные свойства RepA, а также роль бактериального белка DnaA в репликации фага N15 и репликации N15 в процессе литического развития.
Регуляция репликации и конроль числа копий профага N15
Целью этой части работы является создание систем экспрессии белков в клетках Е. coli, сочетающих высокий уровень экспрессии продукта с большим диапазоном регуляции (т.е. низким базовым уровнем). Основная идея нашего подхода состоит в использовании регулируемого промотора в сочетании с плазмидным репликоном, число копий которого может регулироваться в широком диапазоне, от 3-4 до 100 на хромосому. Диапазон регуляции синтеза продукта будет расширен за счет перемножения эффектов активации промотора и эффекта дозы гена. Стабильное наследование вектора в неселективных условиях предполагается обеспечить за счет использования механизма правильного распределения реплицированных плазмидных молекул между дочерними клетками перед делением.
Выбор в качестве основы для создания новой экспрессионной системы генетических элементов умеренного бактериофага N15 был обусловлен целом рядом его специфических особенностей, в том числе установленных в предыдущих разделах данной работы. Во-первых, в лизогенном состоянии фаг не интегрируется в хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся линейную плазмиду. Во-вторых, фрагмент ДНК N15, включающий только один ген, rep А, может реплицироваться в клетках Е. coli в форме кольцевой миниплазмиды. В-третьих, геном фага N15 содержит ген репрессора сВ, продукт которого связывается с промотором гена герА, контролирует уровень его экспрессии и, тем самым, обеспечивает низкое число копий профага и миниплазмид, а также ген антирепрессора antA, продукт которого может инактивировать СВ репрессор, в результате чего число копий плазмиды возрастает в 50-100 раз. В-четвертых, фаг N15 обладает собственной системой сегрегационной стабильности, обеспечивающей его стабильное наследование в неселективных условиях.
Таким образом, геном N15 содержит все необходимое для создания искусственной стабильной системы экспрессии с широкими возможностями регуляции процесса: участок размером около 6 т.п.н., способный обеспечивать репликацию низкокопийной миниплазмиды, ген антирепрессора (ant А), в результате экспрессии которого число копий плазмиды может быть увеличено в 50-100 раз, и оперон (sop), за счет экспрессии которого in trans достигается её стабильное наследование.
Конструирование серии экспрессионных pN15E векторов
Все N15 векторы основаны на фрагменте ДНК фага N15 (с 28887 по 35000 н.п), который содержит гены 34, 35, 36, герА и сВ. Этого фрагмента достаточно для репликации кольцевой низкокопийной плазмиды, более того, гены 34 - 36 несущественны для репликации (Ravin et al., 2003). На рис. 19 показаны детали конструкции pN15E векторов. Сконструированные экспрессионные вектора содержат репликон фага N15 и ген устойчивости к канамицину, в то же время, имеют разные индуцируемые промоторы.
Первый вектор, pN15E4 (Рис. 19), содержит регуляторные элементы из арабинозного оперона Е. coli - ген araC и araP& D промотор, далее следует полилинкер MCS (MCS 1), который включает оптимизированную последовательность сайта связывания рибосом SD (Shine and Dalgarno, 1974; Stormo et. al., 1982) между Nhel и Spel сайтами, перед трансляционном старт-кодоном (ATG) в Ncol сайте. В случае, если трансляция клонируемого гена должна инициироваться с его собственного старт-кодона, ген должен быть клонирован по сайту Spel. После полилинкера следует терминатор транскрипции фага лямбды ТО, введенный с целью предотвращения транскрипции нецелевых генов вектора при индукции araPsAD промотора.
Конструирование вектора pN15E4 осуществляли путем объединения трех модулей (рис. 19). Первый фрагмент, вырезанный из низкокопийной плазмиды pG591 (Ravin et al., 2003) по сайтам Bsp\l9l-Notl, содержал в себе участок, необходимый для репликации ДНК включая ген г ер А, ген репрессора сВ, а также ген устойчивости к канамицину. Второй модуль, фрагмент вырезанный из плазмиды pBAD24 по сайтам Clal-Nhel, содержал ген araC и промотор агаРвдо (Guzman et al., 1995). Третий модуль, включающий в себя полилинкер(МСЗІ) и терминатор транскрипции фага лямбда ТО, был ПЦР-амплифицирован с помощью праймеров Т0-1 и ТО-2, в качестве матрицы брали ДНК фага лямбда. Затем этот ПЦР-фрагмент был обработан рестриктазами Nhel и Noil, сайты которых были введены в праймеры на 5 концах. Эти три фрагмента были объединены путем лигирования по липким концам, в результате чего была получена плазмидар№5Е4.
Второй вектор, pN15E6 (рис 19), вместо агаРвдо содержит сильный промотор фага Т5, перекрывающийся двумя Lac операторами, полученный из pQE60 (QIAGEN, Bujard et al., 1987). После промотора следует полилинкер MCS2, включающий в себя сайт связывания рибосом и трансляционный старт кодон, расположенный в Ncol сайте. Два терминатора транскрипции распологаются рядом с промотором: четыре тандемные копии терминатора транскрипции ТІ рибосомного оперона Е. coli ггпВ в их естественной ориентации расположены перед промотором. После полилинкера расположен терминатор транскрипции фага лямбды ТО. (А)
(A) Этапы конструирования pN15E векторов (смотри материалы и методы). Гены показаны серыми стрелками, промоторы - черными стрелками, терминаторы транскрипции - закрашенными прямоугольниками.
(B) Последовательность полилинкеров (MCS) векторов pN51E. Представлены только уникальные сайты. Старт - кодон ATG, находящийся в сайте рестрикции фермента Ncol - заштрихован.
Вектор pN15E6 был получен в два этапа. Сначала из pN15E4 был удален фрагмент araC- araPsAD по сайтам Д/ЛІ и Ncol, и на его место был клонирован фрагмент Xhol-Ncol из плазмиды pQE60, содержащий РТ5-1ас промотор. В результате была сконструирована плазмида pN15E5. Затем в сайт Muni, расположенный перед промотором РТ5-1ас, был вставлен фрагмент Stul-Smal из pRS551, который содержал 4 тандемные копии терминатора транскрипции ТІ из ггпВ оперона Е. coli (Trrn). В результате был получен вектор pN15E6.
Нуклеотидные последовательности векторов представлены в GenBank (NCBI) под номерами EF392865 (pN15E4) и EF397941 (pN15E6).
Для обеспечения корректного функционирования экспрессионных систем был сконструирован штамм Е. coli, содержащий интегрированные в хромосому ген антирепрессора antA под контролем агаРвло промотора, регуляторний ген арабинозного оперона агаС и sop оперон фага N15. Для обеспечения репрессии РТ5-/ас промотора в отсутствии индуктора в хромосому также был интегрирован ген репрессора лактозного оперона ІасР, обеспечивающий высокий уровень синтеза Lad. Фрагмент ДНК, содержащий все выше описанные гены, был интегрирован в хромосому Е. coli штамма DH10B, в результате чего был получен штамм DH31sopLacI.
Для конструирования штамма DH31soplacI были использованы плазмиды и методики, описанные в работе Piatt et al. (2000). Ее смысл состоит в клонировании желаемых элементов в плазмиде (pCDl 1PSK), содержащей attP сайт фага лямбда, затем эту плазмиду интегрируют в хромосому Е. coli в сайт интеграции фага лямбда.
Основные этапы конструирования штамма показаны на рисунке 20. На первом этапе Pcil-Hindlll фрагмент плазмиды рСА12 (Ravin et al., 1999), который содержал агаС ген, промотор araP и ген antA фага N15 под контролем этого промотора, клонировали в плазмиде pCDHPSK (Piatt et al., 2000) по сайтам BsplAJl и Hindlll, в результате чего была получена плазмида pCDll-ЗІ. На втором этапе Hpal-Hindlll фрагмент плазмиды pUCl-6inv (Ravin and Lane, 1999), который включал в себя sop оперон под контролем его собственного промотора, был клонирован по сайтам Hindi и Hindlll в плазмиде pCDll-ЗІ, в результате бьиа получена плазмида pCDl 1-31 sop. На третьем этапе фрагмент ДНК, который содержал lacfi , был получен с помощью ПЦР (праймеры lacI-F и lacI-R) из плазмиды pZS4int-l (Lutz and Bujard, 1997).
