Введение к работе
Актуальность проблемы
Терминальные клетки многих видов эукариот содержат специфические рибонуклеопротеиновые гранулы, выявляемые на электронных микрофотографиях по повышенной электронной плотности. В процессе овогенеза Drosophila эти гранулы образуют околоядерную структуру в питающих клетках ооцита, называемую nuage, а также локализуются на заднем полюсе развивающегося ооцита, где составляют полярные гранулы, или полярную плазму. Показано, что nuage вовлечен в трансляционный контроль специфических мРНК, транспортируемых из ядра (Findley et al, 2003; Snee and Macdonald, 2004). Недавние исследования выявили участие компонентов nuage в биогенезе piPHK (коротких РНК, ассоциированных с белками подсемейства PIWI семейства ARGONAUTE), а также в ріРНК-зависимом сайленсинге ретротранспозонов и некоторых других вредоносных элементов генома (Lim and Kai, 2007; Lim et al, 2009). ріРНК-путь представляет собой эволюционно консервативный механизм защиты целостности генома в терминальных тканях эукариот (Aravin et al, 2007; Thomson and Lin, 2009). У Drosophila melanogaster белки подсемейства PIWI семейства ARGONAUTE, - Piwi, Aubergine (Aub) и Argonaute3 (AG03), - ассоциированные с короткими РНК длиной 25-30 нуклеотидов, являются ключевыми участниками ріРНК-пути (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006; Brennecke et al, 2007; Gunawardane et al, 2007; Li et al, 2009). В яичниках Drosophila Aub и AG03 осуществляют посттранскрипционный сайленсинг мРНК ретротранспозонов посредством так называемого «пинг-понгового» амплификационного цикла (Brennecke et al, 2007; Gunawardane et al, 2007). Показано, что Aub взаимодействует преимущественно с антисмысловыми piPHK, происходящими из специализированных геномных «мастер-локусов», тогда как AG03 главным образом ассоциирован со смысловыми piPHK (Nishida et al., 2007; Li et al., 2009). Длинные смысловые предшественники piPHK (транскрипты транспозонов и др.) покидают ядро и предположительно распознаются антисмысловыми комплексами, содержащими Aub и piPHK (anti-sense piRISC, piRNA-induced silencing complex), которые разрезают транскрипты с образованием вторичных смысловых piPHK. Эти вновь образованные смысловые piPHK формируют комплексы с AG03 (sense piRISC), которые в свою
очередь узнают и процессируют длинные антисмысловые транскрипты с образованием антиСмысловых piPHK. Антисмысловые piPHK образуют комплексы с Aub, и процесс повторяется циклически (Brennecke et al, 2007; Gunavvardane et al, 2007). Цикл амплификации piPHK, по-видимому, происходит в околоядерных РНП-содержащих гранулах nuage питающих клеток ооцитов Drosophila (Lim and Kai, 2007; Li et al, 2009;; Lim et al, 2009; Malone et al, 2009). Вместе с Aub и AG03 в piPHK-опосредованном сайленсинге ретротранспозонов и эндогенных повторов Stellate (в семенниках Drosophila) принимают участие некоторые другие белки (Maelstrom, Krimper, Spindle Е, Squash, Zucchini, Cutoff, Tejas), которые, нар жу с белками, участвующими в деградации мРНК (DCP1, МеЗШ, Pacman), также присутствуют в nuage питающих клеток (Harris and Macdonald, 2001; Findley et al, 2003; Snee and Macdonald, 2004; Lim and Kai, 2007; Chen et al, 2007; Pane et al, 2007; Lim et al, 2009; Patil and Kai, 2010). Основным маркером nuage является РНК-хеликаза Vasa -трансляционный регулятор некоторых мРНК (Liang et al, 1994; Findley et al, 2003; Snee and Macdonald, 2004). Околоядерная локализация Aub, Krimper и Maelstrom зависит от присутствия Vasa (Lim and Kai, 2007), однако точная функция данного белка в формировании nuage остается неизвестной.
Несмотря на повышенный интерес к составу и функциям nuage, практически все исследования были проведены на яичниках Drosophila, и в семенниках эта структура изучена мало. Локализация белков Vasa и Aub в околоядерной области сперматоцитов была продемонстрирована с помощью микросъемки нефиксированных органов с использованием трансгенных конструкций GFP-Vasa и GFP-Aub (Snee and Macdonald, 2004). Известно, что транскрипты Х-сцепленных тандемных повторов Stellate являются основными мишенями ріРНК-сайленсинга в семенниках Drosophila (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006; Nishida et al, 2007; Nagao et al, 2010). В норме экспрессия этих повторов строго подавляется при участии Y-сцепленного локуса crystal, кодирующего повторы Suppressor of Stellate (Su(Ste)), которые являются источником антисмысловых piPHK. В отсутствии данного локуса в сперматоцитах происходит гиперэкспрессия генов Stellate, в цитоплазме и ядре накапливаются игло- и звездоподобные белковые кристаллы, нарушаются процессы конденсации и сегрегации хромосом в мейозе, что , в конечном итоге, приводит к стерильности самцов (Hardy et al, 1984; Livak, 1984; Palumbo et al, 1994). Ряд белков-
компонентов nuage в яичниках (Aub, AG03, Spindle Е, Zucchini, Squash, Tejas) также необходим для сайленсинга повторов Stellate в семенниках (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006; Nishida et al, 2007; Pane et al, 2007; Li et al, 2009; Patil and Kai, 2010; Nagao et al, 2010). Однако в настоящее время практически ничего не известно о клеточных структурах, осуществляющих сайленсинг генов Stellate и мобильных элементов в герминальных клетках самцов Drosophila. Настоящая работа посвящена исследованию nuage в сперматоцитах, выявлению его белкового состава и роли в процессах ріРНК-пути.
Цель и задачи работы
Целью работы являлась структурно-функциональная характеристика гранул nuage в герминальных тканях самцов Drosophila melanogaster. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Изучить распределение и гетерогенность частиц nuage в герминальных клетках, находящихся на различных стадиях сперматогенеза;
-
Выявить белки, составляющие крупные околоядерные гранулы, piNG-body, обнаруженные в настоящей работе в первичных сперматоцитах наряду с регулярными небольшими гранулами;
-
Изучить влияние мутаций по компонентам nuage на репрессию генов Stellate и стабильность piNG-body;
-
Изучить влияние симметричного метилирования остатков аргинина в белке Aubergine на его локализацию в nuage и функционирование в ріРНК-пути.
Научная новизна работы
В настоящей работе была показана гетерогенность гранул nuage по размерам. Наряду с мелкими гранулами, разбросанными вблизи поверхности ядер сперматогониев и первичных сперматоцитов, в первичных сперматоцитах на ранней стадии G2 мейотической интерфазы впервые обнаружены более крупные структуры, по одной на клетку, обогащенные белками Vasa, Aub и AG03. Эти структуры, по объему превосходившие малые гранулы более чем в 50 раз, были названы piNG-body (piRNA Nuage Giant body). В составе piNG-body были выявлены 10 белков, большая
часть которых описана ранее как компоненты nuage в яичниках и участники piPHK-пути (Vasa, Aub, AG03, Spindle-E, Tudor Squash и Cutoff). Еще два из найденных белков, AG01 и Belle, известны как компоненты микроРНК-пути. Белок DCP1 является основным фактором, осуществляющим декэпирование мРНК в различных тканях. piNG-body присутствует в сперматоцитах в течение стадии G2 и исчезает в ее конце. На последующих стадиях сперматогенеза, в постмейотических круглых сперматидах и далее, гранулы nuage обоих типов обнаружены не были.
Значительный размер piNG-body позволил выявить взаимное расположение белков-компонентов. Vasa и Aub были обнаружены в периферических участках piNG-body, образующих несколько долей вокруг центра, тогда как AG03, напротив, был обнаружен только в центральной доле и колокализовался с Vasa лишь вдоль границ окрашенных участков. Большинство других выявленных компонентов piNG-body также располагалось во внешних долях.
Проведенный в работе мутационный анализ по компонентам piNG-body, участвующим в ріРНК-зависимом сайленсинге генов Stellate, показал, что мутации vasa и aub и ago3 приводят к исчезновению piNG-body, в то время как мутации squ и spnE не нарушают локализацию Vasa и Aub в piNG-body, но, предположительно, приводят к формированию нефункциональной гранулы.
Ранее было показано, что симметричное метилирование остатков аргинина в RG-богатых участках белков подсемейства PIWI Aub и AG03, осуществляемое аргининметилтрансферазой Capsuleen (Csul, или Dart5), необходимо для взаимодействия этих белков с белками, содержащими домены Tudor, и функционирования в ріРНК-пути (Kirino et al, 2009; Nishida et al, 2009). В ходе настоящей работы было обнаружено, что мутация csul приводит к разрушению piNG-body, сопровождаемому дерепрессией повторов Stellate и нарушением биогенеза ріРНК в семенниках. Эти данные также свидетельствуют о том, что концентрация и компартментализация макромолекулярных комплексов, достигнутая в найденной грануле, по-видимому, существенна для эффективной кинетики посттранскрипционного ріРНК-зависимого сайленсинга мРНК.
Практическая значимость
Мутации, приводящие к нарушениям сперматогенеза, критически влияют на воспроизводство и поддержание вида. В геноме обнаружено множество локусов, повреждения которых приводят к полной или частичной стерильности. Показано, что ряд мутаций в генах, участвующих в ріРНК-зависимом сайленсинге, таких как аиЪ, ago3, armi, spnE и др., приводит к гиперэкспрессии генов Stellate и к последующим нарушениям процесса сперматогенеза (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006; Nishida et al, 2007; Nagao et al, 2010). Регуляция генетической системы crystal-Stellate в настоящее время является объектом активного изучения, однако многие детали ріРНК-зависимого сайленсинга Stellate еще не известны. Результаты данной работы позволяют предположить, что обнаруженные в ней крупные гранулы nuage, piNG-body, являются клеточными компартментами, в которых происходит продукция piPHK и piPHK-зависимый сайленсинг Stellate. Таким образом, специализированные клеточные структуры созданы для защиты целостности генома и предотвращения нарушений сперматогенеза в терминальных тканях самцов Drosophila.
Более столетия назад в цитоплазме терминальных клеток млекопитающих было найдено хроматоидное тельце, предполагаемый гомолог nuage. Хроматоидное тельце состоит из электронно-плотного материала и движется вокруг ядра, вступая в прямой контакт с ядерной оболочкой и ядерными порами (Parvinen and Parvinen; 1979; Ventela et al, 2003; Yokota, 2008). Считается, что основная функция этой структуры состоит в сортировке и процессинге мРНК, поступающих из ядра. Существенным компонентом хроматоидного тельца является гомолог белка Vasa Drosophila (Kotaja and Sassone-Corsi, 2007). Обнаруженное в данной работе piNG-body, по видимому, является структурно-функциональным гомологом хроматоидного тельца. Найденные в piNG-body и в хроматоидном тельце компоненты piPHK- и микроРНК-путей свидетельствуют о возможной интеграции различных механизмов РНК-интерференции в терминальных тканях. Полученные в работе данные позволяют использовать Drosophila melanogaster в качестве модельного объекта для изучения механизмов РНК-интерференции и их нарушений в процессе сперматогенеза млекопитающих.
Апробация работы
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: 9-я конференция молодых ученых Института молекулярной генетики РАН (Москва, 18 октября 2010 г.); XXIII международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 7-Ю февраля 2011г.); 52nd Annual Drosophila research conference (Сан-Диего, Калифорния, США, 30 марта - 3 апреля 2011 г.); V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.).
Публикации
По теме работы опубликовано 4 статьи в международных реферируемых журналах.
Материалы и методы
Линии Drosophila melanogasler, использованные в работе: В настоящей работы были использованы терминальные ткани взрослых самцов D.melanogasler следующих линий:
Canton S - природная линия дикого типа;
Df(l)w67c23(2> - использована в качестве контроля; в работе обозначена yw;
yw67c23;cry1Bs,Yy+;P(pCaSpeR-6Ste-lacZ) - несет делецию локуса crystal в Y-хромосоме, а также содержит вставку Р-элемента с 6 тандемными копиями гена Stellate во 2-й хромосоме; в работе обозначена cry;
aub"Ncn'bw'/CyO и w"'8;aubQC42cnbw'/CyO - линии с мутациями в гене aubergine; aubflN/aubQC42 - трансгетерозиготная аллельная комбинация;
bw';st'ago3t2/TM6B,Tb+ и bw'' ;st'ago3,3/TM6B,Tb' - линии с мутациями в гене argonaute3; ago3'2/ago3'3 - трансгетерозиготная аллельная комбинация;
ru'st'spn-E1 e!ca'/TM3,Sb'Ser' - линия с мутацией в гене spindle Е; spn-E616 (spn-E1) -гомозиготы по мутации;
vasEP812, vas01, vasPD, va/"165 - линии с мутациями в гене vasa;
sqifF32 en' bw1 /СуО - линия с точечной мутацией в гене squash; w"'s;Df(2L)Exefm/CyO и w'"8;Df(2L)ED"09,P[3'.RS5+3.3']ED,m/SM6a несут делении, перекрывающие область гена squash. squpp32/Df(2L)Exel7066 и squPP32/Df(2L)ED"09 - трансгетерозиготные аллельные комбинации;
tud bw'sp /СуО - линия с точечной мутацией в гене tudor,
cuffws и cuff00595' - линии с мутациями в гене cutoff, cuffаот>/cuffШ5 -трансгетерозиготная аллельная комбинация;
knfi-'rn-'befpp/TM3,Sb', w'"8;fs(3)*'mwh'P[hsneo]bero30red'e'/TM3,Sb'Ser',
P[PZ]berp-'ry506/TM3,ryRKSb'Ser'', y'w67c23;P[EPgy2]beFom3 - линии с мутациями в гене belle; ЬеГео30/ЬеҐ - трансгетерозиготная аллельная комбинация; befap-> и befnm3 - гомозиготы по мутации;
csuf^50 - линия с мутацией в гене capsuleen (DartS, dPRMT5); w'"s;Df(2R)BSC309/CyO, wa^"-g;Df(2R)Jp7,w*/CyO - линии с делецями, перекрывающими район гена capsuleen; csui /Df(2R)Jp7 и csul /Df(2R)BSC309 (Df23692) - трансгетерозиготные аллельные комбинации.
Молекулярно-биологические методы:
Скрещивания особей Drosophila, микродиссекцию и фиксацию органов, получение лизатов, выделение РНК, Вестерн-блот-анализ и Нозерн-блот-анализ проводили согласно опубликованным стандартным протоколам. Получение иммуноокрашенных препаратов для конфокальной микроскопии проводили по улучшенной автором методике, благодаря которой удалось добиться полноценного прокрашивания семенников. Съемка препаратов проводилась при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss). Полученные данные были импортированы в программный пакет Imaris 5.0.1 (Bitplane AG) для последующей обработки.
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на // ~ страницах машинописного текста, содержит/7 рисунков и S таблиц. Список цитированной литературы состоит из І23 работ.
