Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ), как и прежде, продолжает оставаться актуальной для здравоохранения Российской Федерации (РФ) и имеет медицинское и социальное значение В структуре общероссийской заболеваемости КЭ наибольший удельный вес приходится на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока, где показатели заболеваемости в 2-3 раза превышают общероссийские показатели (2005-2007 гг) (Онищенко Г Г., 2007).
Со времени открытия КЭ наблюдается эволюция инфекции существенное расширение нозоареала, рост заболеваемости, изменение экологической ситуации, антропогенная трансформация природных очагов Изменилась эпидемиология КЭ. из болезни лиц, профессионально связанных с лесом, КЭ стал болезнью преимущественно невакцинированных городских жителей (Злобин В И, 2006, Волкова ЛИ и др, 2004) Как в 40-50-с годы XX века, так и в настоящее время, наряду с трансмиссивным заражением регистрируется и алиментарное - через сырое молоко коз и коров (Дружинина Т А, Погодина В В и др, 2002) За минувшие 20 лет накоплена новая большая информация о широком распространении сочетанных очагов КЭ и других клещевых инфекций, особенно с иксодовыми клещевыми боррелиозами (Коренберг Э И , 2004, Данчинова Г А , 2006, Карань Л С и др, 2006, Козлова ИВ и др, 2006)
Связь эволюции КЭ с эволюцией возбудителя крайне мало изучена Молекулярно-эпидемиологические исследования последних лет показали циркуляцию на территории России трех подтипов ВКЭ дальневосточного, сибирского (урало-сибирского) и европейского (Вотяков ВИ и др, 2002, Злобин ВИ и др , 2003, Погодина В В и др, 2004) Дальневосточный подтип доминирует в Приморском (Леонова ГН, Беликов СИ и др, 2007), Хабаровском краях, на острове Сахалин (Злобин ВИ и др, 2003), составляет до 50-70% вирусной популяции в республике Бурятия и Читинской области (Погодина В В и др, 2004, Погодина В В , 2005) Ареал сибирского подтипа чрезвычайно широїс, он доминирует на большей части территории страны, включая Центральный, Уральский, Северо-западный регионы, Западную Сибирь, многие районы Иркутской области, Красноярского края (Адельшин Р В и др, 2006, Верхозина М М. и др, 2006, Погодина В.В , 2005) Остается неясным, когда и почему сибирский подтип стал доминантным компонентом природных вирусных популяций
Одним из методов изучения эволюции вирусов является генетический анализ хронологических рядов штаммов (Цилинский Я Я, 1988) Построить хронологические ряды ВКЭ возможно для немногих территорий из-за утраты изолятов, выделенных в начале документированного исторического периода Коллекция штаммов ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова РАМН позволяет изучать эволюцию популяций ВКЭ в хронологическом и территориальном аспектах
Цель и задачи исследования. Целью работы явилась характеристика современной структуры популяций ВКЭ в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России, вирусологическая и генетическая характеристика изолятов РНК и штаммов ВКЭ в хронологическом аспекте
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
-
Сформировать хронологические ряды штаммов и изолятов РНК ВКЭ как основу для проведения мониторинга вирусных популяций в Уральском, Западносибирском и Северо-западном регионах России на протяжении 30-60-летнего периода
-
Проанализировать изменение эпидемиологической и экологической ситуации в обследуемых регионах в течение документированного исторического периода
-
Провести ретроспективное генотипирование штаммов, изолированных в 40-70-е годы XX века в Свердловской, Кемеровской, Вологодской областях
-
Изучить генетическую структуру современных популяций ВКЭ, распространенных в Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областях
-
Использовать для генотипирования ВКЭ современные методы лабораторной диагностики полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с геногипепецифическими зондами, метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и метод секвенирования
-
Провести секвенирование участков генома ряда штаммов ВКЭ для изучения генетической гетерогенности сибирского подтипа ВКЭ
-
Изучить на лабораторных моделях вирулентность и инвазивные свойства современных штаммов ВКЭ, циркулирующих на изучаемых территориях
-
Для уточнения западной границы ареала сибирского подтипа ВКЭ провести генотипирование дополнительного набора штаммов
Научная новизна Впервые дана характеристика структуры современных популяций ВКЭ, распространенных в различных ландшафтных зонах Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей
Впервые изучено изменение структуры вирусных популяций КЭ на территории изучаемых областей за 30-60-летний период
Выявлены генетические особенности штаммов ВКЭ сибирского подтипа, распространенных на данных территориях
Впервые описаны «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей, представляющие собой смесь различных подтипов
Изучена вирулентность штаммов ВКЭ, циркулирующих на современном этапе в Уральском и Северо-западном регионах России
Практическая значимость работы. В результате 4-летнего изучения современной структуры популяций ВКЭ в Свердловской области (2003, 2004, 2006, 2007 гг) установлено доминирование сибирского подтипа ВКЭ (94,4 - 100%) Значение этих данных определяется тем, что в Свердловской области проводится кампания массовой вакцинации населения четырьмя вакцинами, приготовленными из штаммов дальневосточного и европейского подтипов, генетически отличных от циркулирующих в природных популяциях ВКЭ Несмотря на генетическое несоответствие между природными популяциями ВКЭ и вакцинными штаммами, массовая вакцинация населения дала высокий эпидемиологический эффект Достигнутый успех вакцинации в
сопоставлении с нашими данными о структуре природных популяций ВКЭ позволяет заключить, что существующие вакцины против КЭ могут быть рекомендованы для использования и в других регионах, где доминирует сибирский подтип ВКЭ (Кемеровская, Курганская, Вологодская и другие области)
Нуклеоіидньїе последовательности полноразмерного гена белка Е 10 изолятов РНК и 25 штаммов ВКЭ депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank (http //www ncbi nlm nih gov/GenBank. № FJ214112, FJ214113, FJ214115, FJ214116, FJ214117, FJ214118, FJ214119, FJ214120, FJ214121, FJ214122, FJ214123, FJ214124, FJ214125, FJ214126, FJ214127, FJ214128, FJ214129, FJ214130, FJ214131, FJ214132, FJ214133, FJ214135, FJ214136, FJ214137, FJ214138, FJ214139, FJ214140, FJ214141, FJ214142, FJ214143, FJ214149, FJ214150, FJ2I4I5I, FJ214152, FJ214153) Основные положения, выносимые на защиту.
-
Впервые проведен мониторинг структуры популяций ВКЭ на основе генотипирования хронологических рядов штаммов и изолятов РНК ВКЭ
-
На территориях Свердловской, Курганской, Кемеровской и Вологодской областей на современном этапе циркулирует преимущественно сибирский подтип ВКЭ (94,4 - 100% вирусной популяции)
-
В Свердловской и Кемеровской областях отмечено преобразование вирусных популяций с общей тенденцией - заменой дальневосточного подтипа сибирским подтипом ВКЭ за 50-60-летний период
-
Выявлены генетические особенности сибирского подтипа ВКЭ, распространенного в Вологодской области
-
Современные штаммы ВКЭ, изолированные в Уральском и Северозападном регионах России из клещей / persulcatus, характеризуются высокой вирулентностью и нейроинвазивностью в экспериментах на белых мышах В опытах на сирийских хомяках штаммы сибирского подтипа вызывают замедленное развитие патологического процесса Штаммы дальневосточного подтипа индуцируют быстрое развитие заболевания и гибель 100% зараженных животных.
-
Политиповые или «микст-штаммы» ВКЭ, изолированные из клещей / persulcatus, имеют генетические структуры сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ, что подтверждено методами ПЦР и ПДРФ
Апробация работы Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (Москва, 2007), расширенном заседании ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М П Чумакова РАМН, проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» совместно с Федеральным государственным унитарным предприятием «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им МП Чумакова» РАМН (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006)
Апробация диссертационной работы состоялась 10 Об 2008 г. на заседании межлабораторного ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 166 работ отечественных и 82 работ зарубежных авторов Диссертация изложена на 216 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 таблицами и 21 рисунком
