Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1 Общая характеристика флавивирусов 7
Структура и функции белков флавивирусов. 10
Цикл репродукции флавивирусов. 15
2 Молекулярные основы вирулентности флавивирусов . ...20
-
Хозяин-специфические детерминанты флавивирусов 23
-
Эволюция флавивирусов 25
-
Экология ВКЭ 30
-
ПОПУЛЯЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ РНК-содержащих ВИРУСОВ 32
-
Общие положения 32
-
Изменения приспособленности 38 7. Популяция вируса и смена хозяев »43
-
Общие положения . . 43
-
Фенотипические и генетические изменения вирусов ККЭ при адаптации к клещам и млекопитающим. . 46
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52
-
Использованные в работе вирусы 52
-
Кулы ура клеток 53
-
Животные 53
-
Клещи 53
-
Иммунные сыворотки и моноклональные антитела 53
-
Олигонуклеотиды 53
-
Титрование инфекционного вируса 58
-
Клонирование вируса методом бляшек 58
-
Титрование ВКЭ на мышах 58
10 Опыт на клещах 59
-
Реакция гемагглютинации 59
-
Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток 59
-
Ракетный иммуноэлектрофорез 59
-
Сорбция на гепарин сефарозь 60
15 Сорбция на эритроцитах . 60
-
иммуноферментный анализ 60
-
иммунопреципитациявирусспецифических белков 61
-
Электрофорез белков в полиакриламидном геле. ... . 62
-
Выделение РНК 63
-
Обратная транскрипция 63
-
полимеразная цепная реакция 64
-
Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 65
-
Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы 65
-
Определение нуклеотидной последовательности 67
-
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 69
-
Me год доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах 69
РЕЗУЛЬТАТЫ 71
-
Фенотипическая характеристика варианта М 71
-
Определение полной нуклеотидной последовательности генома штамма ЭК-328 и выявление его филогенетического положения среди штаммов ВКЭ 74
-
Сравнение полных Поспелова і ьльностей геномов штамма ЭК-328 и вариантам 75
-
Сравнение антигенной структуры белка Е ш гамма ЭК-328 и варианта М 80
-
Характеристика ревертантов, полученных при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ с помощью клонирования 83
-
Получение клонов из популяции варианта М, обладающих крупнобляшечным и мелкобляшечным фенотипом. 83
-
Сорбция на гепаринсефарозе 89
-
Оценка вирулентности для мышей дополнительно клонированных ревертантов. 90
5.4. Сорбция на эритроцитах 91
-
Разработка метода доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах 92
-
Оценка способности варианта М, штамма ЭК-328 и клона 116/59 попадать и персистировать в ЦНС мыши после периферического введения с помощью ОТ-ПЦР 95
8 Поведение популяции варианта М при репродукции in vivo 97
9. Поведение популяции варианта М при пассажах через мозг мыши 99
10 Пассажи варианта М в культуре клеток СПЭВ 100
11. ОПЫТ ПО СМЕШАННОЙ ИНФЕКЦИИ ШТАММА ЭК-328 И АДАПТИРОВАННОГО К КЛЕЩАМ ВАРИАНТА М В
КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК СПЭВ 101
ОБСУЖДЕНИЕ 103
1 ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ДАННОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЯ СВОЙСТВ ПОПУЛЯЦИИ ВКЭ
ПРИ СМЕНЕ ХОЗЯИНА 103
-
ВЫЯВЛЕНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ ШТАММА ЭК-328 СРЕДИ ШТАММОВ ВКЭ 104
-
СРАВНЕНИЕ ГЕНОМОВ РОДИТЕЛЬСКОГО ШТАММА ЭК-328 И ВАРИАНТА М 106
4 ВЫЯВЛЕНИЕ ЗАМЕН, СВЯЗАННЫХ С ФЕНОТИПОМ Ш
5. РОЛЬ МУТАЦИЙ, ПОВЫШАЮЩИХ АФФИННОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ С ГАГ, В ПРОЯВЛЕНИИ СВОЙСТВ ВКЭ. 114
6 ПОВЕДЕНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ВАРИАНТА М ПРИ СМЕНЕ ХОЗЯИНА 120
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 128
Список сокращений
а.к. - аминокислота(ы);
б/п - беспородные;
БОЕ - бляшкообразующая единица;
ВА - вирионный антиген;
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита;
ВС - везикулярный стоматит;
ВЭЛ - восточный энцефалит лошадей;
ГА - гемагглютинирующая активность;
ГАГ - гликозаминогликаны;
ГС - гепаринсефароза;
дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат;
ЖЛ - желтая лихорадка;
ИП - иммунопреципитация;
и/п - интраперитонеально;
ИПБ - иммуно-преципитационный буфер;
ИФА- иммуноферментный анализ;
и/ц - интрацеребрально;
КЖ - культуральная жидкость;
ККЭ - комплекс клещевого энцефалита
КЭ - клещевой энцефалит;
ЛЗН - лихорадка Западного Нила;
ЛСБ - ламинин-связывающий белок;
М.в. - молекулярный вес;
МС - мозговая суспензия;
НА - невирионный антиген;
нт - нуклеотид (ы);
НТО - нетранслируемая область;
ОРС - открытая рамка считывания;
ОТ - обратная транскрипция;
ПААГ— полиакриламидный гель;
п/к - подкожно;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РГА - реакция гемагглютинации;
РДПА - реакция диффузной преципитации в агаре;
РИЭФ - ракетный иммуноэлектрофорез;
РНБ - реакция нейтрализации бляшек;
СПЭВ - культура клеток почек эмбриона свиньи;
ЦНС - центральная нервная система;
ЦПД - цитопатическое действие;
ЭДМ - энцефалит долины Мюррей;
ЭПР - эндоплазматический ретикулум;
ЯЭ - Японский энцефалит.
Введение к работе
На современном этапе накоплен большой массив данных по эволюции вирусов. Установлено, что арбовирусы эволюционируют медленнее, чем другие РНК-содержащие вирусы. Тем не менее, среди вирусов этой группы наблюдается внезапное появление новых эпидемически значимых вариантов. Для понимания закономерностей эволюции вирусов, для предсказания появления более вирулентных вариантов или вариантов с измененным тропизмом необходимо изучение микроэволюционных процессов, определяющих уровень и направление изменчивости.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является представителем рода Flavivirus и вызывает тяжелые заболевания человека, такие как энцефалиты и менингиты. Очаги клещевого энцефалита (КЭ) различаются по количеству и тяжести течения заболевания людей. В последние годы в ряде регионов было показано увеличение числа тяжелых форм, появление новых клинических форм заболевания в виде энцефалита с геморрагическим синдром, а также расширение ареала этого вируса.
В природных очагах ВКЭ существует за счет попеременного размножения в клещах и позвоночных. Филогенетические исследования указывают на то, что эволюция флавивирусов определяется прежде всего видом переносчика, хотя определенное значение имеет и вид прокормителя. На фенотипическом уровне показано, что клещи и позвоночные оказывают разное селективное давление на ВКЭ. Однако, информация о хозяин-специфических детерминантах в геноме ВКЭ крайне ограничена. До сих пор нет никаких данных о поведении гетерогенной популяции ВКЭ при смене хозяина, а также в процессе вирусной инфекции.
Цель и задачи работы: Целью данной работы было изучение изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина. Для этого было необходимо решить следующие задачи:
Сравнить полные нуклеотидные последовательности геномов штамма ЭК-328 и варианта М, полученного в результате пассажей штамма ЭК-328 в клещах.
Сравнить антигенную структура белка Е адаптированного к клещам варианта М и родительского штамма ЭК-328.
Изучить изменение свойств популяции варианта М на генетическом и фенотипическом уровне при пассажах in vivo и in vitro.
На основе анализа ревертантов, полученных из популяции варианта М, выявить хозяин-специфические детерминанты в геноме ВКЭ.
Научная новизна.
Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при смене хозяина.
Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки.
Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к комплексному изменению антигенной структуры основного гликопротеина оболочки Е.
Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ на поверхности клетки у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что в процессе реверсии ГАГ-связывающего фенотипа образуются варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции. Научно-практическая ценность.
Получена фенотипическая и генетическая характеристика вариантов, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих.
Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить попадание вируса в мозг и наличие персистенции вируса в ЦНС.
Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского подтипа, депонирована в международной базе данных GenBank (, № DQ486861).
Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.
Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.
