Введение к работе
Актуальность проблемы. Зеленый флуоресцентный белок GFP и его варианты и гомологи представляют собой уникальное семейство белков, способных к образованию хромофорной группы за счет автокаталитической посттрансляционной модификации собственных аминокислотных остатков, происходящей без привлечения внешних кофакторов и ферментов. Благодаря этому свойству, GFP-подобные белки широко используются в современной молекулярной и клеточной биологии в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для прижизненного мечения белков, органелл и клеток. Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФ-белки) составляют особую группу GFP-подобных белков, способных к многократному увеличению яркости флуоресценции в ответ на облучение светом определенной длины волны и интенсивности. ФАФ-белки являются мощным инструментом для точного оптического мечения и последующего слежения за перемещением выбранного объекта (отдельных клеток, внутриклеточных органелл и белков). В последнее время ФАФ-белки успешно применяются в новых методах получения изображений со сверхвысоким разрешением.
Создание новых ФАФ-белков, особенно с эмиссией в красной области видимого спектра, а также новых методов их использования представляется высоко актуальной задачей, позволяющей расширить область применения GFP-подобных белков.
Цели и задачи работы. Целью работы было разработать новые методы анализа деградации и взаимодействий целевых белков на уровне единичных живых клеток с использованием ФАФ-белков. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать метод мониторинга деградации целевых белков с
использованием необратимо фотоактивируемого белка Dendra2.
2. Создать мономерный обратимо фотоактивируемый красный
флуоресцентный белок и применить его для изучения взаимодействия целевых
белков между собой.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показана возможность использования ФАФ-белков для определения скорости деградации целевых белков в режиме реального времени на уровне отдельных живых клеток. Получены и охарактеризованы обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP; выявлены аминокислотные позиции, имеющие определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости мутантов белка TagRFP. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с
использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом. Разработанные методы могут быть широко использованы в молекулярной и клеточной биологии для изучения функционирование белков в живой клетке.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 144 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 5 таблицы.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной летней школе Molecular Imaging (Гейдельберг, Германия, 2006), V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах.
