Введение к работе
Актуальность проблемы
На современном этапе достигнут большой прогресс в идентификации генов, вовлеченных в этиологию моногенных наследственных болезней. Это связано, как с успешным применением стратегии позиционного клонирования и развитием новых технологий, так и с успехами, достигнутыми в расшифровки генома человека. Основной проблемой сейчас является выявление генов, вовлеченных в патогенез мультифакториальных заболеваний. К такому типу заболеваний относятся, прежде всего, болезни сердечно-сосудистой системы, астма, сахарный диабет, многие нейропсихиатрические и неврологические заболевания. Особый интерес представляет изучение молекулярно-генетических основ мультифакториальных неврологических заболеваний, поскольку это позволит, во-первых, выявить новые закономерности в функционировании нервной системы на всех уровнях — от уровня клетки до организма в целом. Кроме того, выявление генетических маркеров данных заболеваний поможет разработать новые методы их диагностики. Разрабатываемые методы лечения и профилактики, в свою очередь, будут максимально учитывать генетические особенности каждого конкретного человека.
К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Болезнь Паркинсона - это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связаішое с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции, однако причины такой избирательной гибели нейронов полностью не выяснены.
С генетической точки зрения БП представлена двумя формами: семейной и спорадической. В 10-15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер. В настоящее время картировано 17 локусов моногенных форм болезіш Паркинсона. Анализ известных локусов и генов БП позволил выделить несколько механизмов, вовлечённых в патогенез паркинсонизма. К их числу, в первую очередь, относятся процессы убиквитин зависимой протеасомной деградации белков, которые часто связаны с мутациями в генах паркіша (PARK2) и а-синуклеина (SNCA). Известно,
что гомозиготіюсть или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 является причиной развития заболевания у примерно половины больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой БП и у примерно 10% спорадических больных с ранним началом развития заболевания. Более того, установлено, что даже в гетерозиготном состоянии мутации в гене PARK2 могут вести к субклиническим нарушениям обмена дофамина в полосатом теле. Эти данные позволяют предположить, что гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 может приводить к БП или повышать риск ее развития при взаимодействии с другими факторами. Для проверки этой гипотезы необходимо проведение массового скрининга мутаций в гене PARK2 у больных спорадической формой БП. Интересной особенностью мутаций в этом гене является высокая частота делеций или дупликаций, захватывающих целиком один или несколько экзонов. Следовательно, анализ мутаций гена PARK2 целесообразно начинать именно с поиска экзонных делеций и дупликаций. Также, сравнительно недавно появились данные о том, что мутации гена SNCA, связанные с изменением его копийности, могут приводить к развитию семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Было показано, что дупликации и трипликации гена SNCA встречаются гораздо чаще, чем точковые мутации данного гена.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось оценить вклад делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA в развитие болезни Паркинсона у пациентов из России. Для этого были поставлены следующие задачи:
Разработка быстрого и эффективного метода анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени.
Анализ делеций и дупликаций всех 12 экзонов гена PARK2 у пациентов со спорадической формой БП с ранним и поздним началом развития заболевания.
Оценка риска развития спорадической БП у носителей делеций/дупликаций экзонов гена PARK2. Анализ корреляции мутаций с изменением копийности с клиническими характеристиками БП.
Анализ дупликаций и трипликации экзонов 4-6 гена SNCA в выборке пациентов сБП.
Научная новизна и практическая значимость работы
Разработан быстрый и эффективный метод выявления делеций и дупликаций экзоиов 1-12 в гене PARK2 и мультипликаций гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени технологии TaqMan.
Впервые проведен анализ спорадических больных с ранним началом развития заболевания (<45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 12,4%, и показано, что наиболее подвержены экзонным перестройкам экзоны 3 и 4. Обнаружено, что относительный риск развития БП у лиц в молодом возрасте при наличии делеций или дупликаций в гене PARK2 повышен в 12,4 раза. Получено подтверждение гипотезы о том, что мутации в гетерозиготном состоянии в гене RARK2 влияют на риск развития заболевания.
Впервые проведен анализ представительной выборки спорадических больных с поздним началом развития заболевания (>45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 3,8%.
Впервые в российской популяции проведен корреляционный анализ в выборках спорадических больных с ранним и поздним началом развития заболевания между наличием экзонных перестроек в гене PARK2 и характерными клиническими признаками БП. Установлено, что наличие экзонных перестроек способствует существенному снижению возраста начала БП (на 9 лет), развитию дистония и симметричному протеканию заболевания и не влияет на скорость и тяжесть протекаїшя болезни.
Впервые проведен анализ больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантным типом наследования на наличие дупликаций и трипликаций гена SNCA. В результате анализа было показано, что мультипликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез БП у больных из России.
Показано, что экзоиные перестройки в гене PARK2 вносят существенный вклад в патогенез БП у больных из России. Разработан эффективный метод их выявления, подходящий, в том числе, для массового скрининга больных в клинических условиях. Выявление данных мутаций на раїших стадиях заболевания может скорректировать терапию и при грамотцом лечении значительно уменьшить тяжесть его протекаїшя. Выявление таких мутаций у лиц из группы риска на доклинической стадии поможет
вовремя принять профилактические меры и, если не предотвратит развитие БП, то отодвинет ее появление на более поздний срок и значительно снизит тяжесть протекания заболевания. В будущем, в том числе с использованием результатов данного исследования, возможно создание единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП по результатам анализа локусов заболевания.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 статьи и 4 материала конференций и симпозиумов.
Апробация диссертации
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Европейского Общества Генетики человека (ESHG) в 2006, 2007 и 2009 гг., на IX Международном симпозиуме по мутациям в геноме (IX International Symposium on Mutations in the Genome, Китай) в 2007 г., на второй Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биотехнология» в 2006 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 19 апреля 2010 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 28 апреля 2010 г.
Структура и объем диссертации
