Введение к работе
Актуальность исследования Поксвирусы, объединенные в семейство Poxviridae, характеризуются самыми крупными размерами вирионов и генома среди вирусов животных, отличаются от вирусов многих других семейств тем, что их жизненный цикл проходит в цитоплазме клеток (Moss, 1996). Наиболее активно в данном семействе изучают вирусы рода Orthopoxvirus, поскольку он содержит патогенные для человека вирусы натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (BOO), оспы коров (ВОК) и осповакцины (ВОВ) (Маренникова и Щелкунов, 1998; Fenner et al., 1989). Особое место в этих исследованиях занимает изучение структурно-функциональной организации генома данных вирусов.
Полагают, что поксвирусы в процессе эволюции включили в состав своей ДНК нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки клетки, которые в первую очередь необходимы для модулирования иммунных реакций организма на вирусную инфекцию, обеспечивая тем самым преодоление данными вирусами различных защитных систем хозяина (Маренникова и Щелкунов, 1998; Alcami and Koszinowski, 2000). Кроме того, в составе генома ортопоксвирусов выявлены гены, продукты которых гомологичны представителям семейств белков клетки, не участвующие напрямую в процессах иммуномодуляции, а регулирующие такие процессы, как клеточный цикл, формирование цитоскелета и т.п. (Shchelkunov et al., 1993; Senkevich et al., 1993). Такие функции, возможно, выполняют белки семейства ВВК, входящего в суперсемейство kelch-подобных белков (Adams et al., 2000).
Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в процессы стабилизации и динамики актиновых филаментов, участвуют в образовании цитоскелета, не только в связанном с актином виде, но и самостоятельно, играют роль в регуляции генной экспрессии, деградации белков с участием протеасом, а также выполняют разнообразные функции в других аспектах
жизнедеятельности клетки и организма и важны для их функционирования (Xue and Cooley, 1993; Laezza et al., 2007; Greenberg et al., 2008; Yu et al., 2008).
В настоящее время известно, что поксвирусы являются единственным семейством в царстве Vim, в составе генома которых выявлены наборы генов ВВК-белков. Несмотря на многочисленность ВВК-генов у ортопоксвирусов функция их до сих пор остается невыясненной.
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является введение направленных делеций в выбранные ВВК-гены ВОК, штамм GRJ-90, и изучение свойств созданных мутантов в системах in vitro и in vivo.
В процессе работы решались следующие задачи:
-
Проведение компьютерного анализа видоспецифических различий генов ортопоксвирусов, кодирующих ВВК-белки.
-
Получение и анализ шести векторных плазмид для интеграции/делеции в целевые гены ВОК: pAA57R, pAB9R, pAB19R, рДС18Ь, pAG3L, pADl 1L.
-
Получение клонового варианта ВОК и создание на его основе рекомбинантных мутантов с единичными и множественными делециями генов, кодирующих ВВК-белки.
-
Изучение влияния делеций ВВК-геиов на биологические свойства полученных вирусов в системах in vitro и in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы Изучение функций генов Дб/С-семейства ортопоксвирусов является важной фундаментальной задачей. Впервые на основании выполненного сравнения геномных последовательностей ВОК, BOO, ВНО, и ВОВ обнаружено, что ВОК содержит 6 генов семейства ВВК, ВОВ - 3, BOO - 1, а в геноме ВНО все эти гены делегированы или мутационно разрушены.
Впервые получены и охарактеризованы шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК: DJJL, C18L, G3L, A57R, B9R и BI9R штамма GRI-90 ВОК.
Впервые созданы 18 мутантов ВОК с делениями как единичных генов DJ1L, CI8L, G3L, A57R, B9R или B19R, так и двух, трех, четырех, пяти и шести генов семейства ВВК, при этом рекомбинанты с множественными (больше одной) делениями были получены с различными сочетаниями удаляемых генов. Показано, что гены этого семейства не являются существенными для репродукции ВОК.
Впервые обнаружено, что у мутантов ВОК с последовательными делениями от одного до четырех генов DHL, C18L, G3L и A57R, кодирующих ВВК-белки, наблюдаются следующие эффекты в зависимости от числа инактивированных генов: изменяется спектр чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена, имеют сниженную способность размножаться в перевиваемой культуре клеток почки собаки (MDCK), а мутанты по четырем генам утрачивают такую способность; в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5С) продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК; мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины значительно меньшего размера и с меньшим содержанием вируса по сравнению с исходным ВОК; удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназалыюм заражении мышей линии BALB/c.
Практическая значимость данной работы состоит в том, что выявленный эффект аттенуации вируса при делегировании генов семейства ВВК может быть применен при получении безопасных вакцин новейшего поколения на основе ВОВ. Метод временной доминантной селекции, использованный в данной работе, в настоящее время применяется нами для создания высоко аттенуированных вариантов ВОВ с целью получения живых противооспенных вакцин нового поколения.
Положения, выносимые на защиту Гены семейства ВВК не являются существенными для репродукции ВОК.
Инактивация генов семейства ВВК у ВОК приводит к следующим эффектам:
1) изменяется круг чувствительных культур клеток, мутанты ВОК,
утратившие три гена {DHL, C18L, G3L), имеют сниженную способность
размножаться в культуре клеток MDCK, а мутанты по четырем генам {DHL,
C18L, G3L, A57R) утрачивают такую способность;
-
мутанты с делециями четырех генов ВВК в культуре клеток CV-1 при температуре 37С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации в течение 72 ч после инфицирования при температуре 39,5С, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным вирусом (р<0,05);
-
мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а исходного ВОК - 2,1±0,33 мм, с меньшим содержанием в них вируса: титр в тройных мутантах составляет 2x10 БОЕ/оспина, в четверных -1,6x105 БОЕ/оспина, по сравнению с исходным вирусом, титр которого определяли как 2x106 БОЕ/оспина (р<0,05);
-
удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса величина LDso составляла 1,1x10s БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона она равна 8,7х105 БОЕ/мышь (р<0,05).
Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликованы 6 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК.
Результаты работы были представлены на на международных и российских научных конференциях:
XHIth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000); XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, England,
2004); Ш международная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, Россия, 2007); XlVth International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, 11 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, 9 разделов результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 17 отечественных и 186 иностранных источников.
Личный вклад автора Получение клонированного варианта ВОК, рекомбинантных мутантов с делециями генов, кодирующих ВВК-белки, ПЦР-анализ полученных вирусов, выполнен лично автором. Схема получения плазмид интеграции разработана СВ. Серегиным. Автором получены и охарактеризованы три плазмиды интеграции. Работы по изучению оспин, индуцируемых делеционными вариантами ВОК на ХАО КЭ, и оценка степени патогенносте полученных ВОК при интраназальном заражении мышей проводили совместно с Г.В. Кочневой и Т.А. Лупан. Микроскопические исследования выполнены Е.И. Рябчиковой и О.С. Тарановым при участии автора в подготовке исходных материалов. Компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, проведен совместно с А.В. Тотмениным, И.В. Бабкиным и Д.В. Антонец.
